【基因測(ce)序(xu)是什么】基因測(ce)序(xu)有(you)什么用(yong) 基因測(ce)序(xu)原理技術
隨(sui)著(zhu)基因測序(xu)(xu)技(ji)術(shu)的(de)發(fa)展和(he)費用(yong)的(de)降(jiang)低(di)，現在(zai)普通人也可以在(zai)可承受的(de)經(jing)濟范(fan)圍內進行個(ge)體測序(xu)(xu)分析，測序(xu)(xu)技(ji)術(shu)成為精準醫學發(fa)展和(he)個(ge)體化治療中(zhong)一(yi)個(ge)非常重(zhong)要的(de)工(gong)具(ju)，我們即(ji)將迎來一(yi)個(ge)全民測序(xu)(xu)的(de)時代。而這樣(yang)一(yi)種強(qiang)大的(de)工(gong)具(ju)在(zai)科學家們的(de)手中(zhong)又(you)可以發(fa)揮出更大價值(zhi)，挖掘出更有深度的(de)信息。基因測序(xu)(xu)技(ji)術(shu)在(zai)精準醫學中(zhong)得(de)到了哪些應用(yong)呢？小編從以下(xia)幾個(ge)方面(mian)結合已發(fa)表文章進行了總結。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在2016年(nian)4月8日那期Science期刊上，美國(guo)布(bu)羅德研(yan)究所(suo)(suo)Aviv Regev的(de)領導的(de)癌(ai)癥(zheng)研(yan)究團(tuan)隊通過與麻省(sheng)理工學(xue)院副教授、單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分析先鋒Alex Shalek合作，利(li)用單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)RNA-seq方法每(mei)次一個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)地研(yan)究整個(ge)腫瘤(liu)(liu)(liu)以便(bian)(bian)確定哪些(xie)類(lei)型的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存(cun)在于(yu)腫瘤(liu)(liu)(liu)中(zhong)。他們不僅分析了(le)惡性腫瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而且也分析了(le)腫瘤(liu)(liu)(liu)內所(suo)(suo)有(you)不同類(lei)型的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。這(zhe)是首(shou)次開展這(zhe)樣的(de)研(yan)究。如(ru)今，他們知道每(mei)種(zhong)腫瘤(liu)(liu)(liu)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)成，也知道每(mei)種(zhong)類(lei)型的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)基因表達模(mo)式，這(zhe)樣就能夠(gou)回個(ge)頭去重(zhong)新(xin)分析一些(xie)大體積腫瘤(liu)(liu)(liu)測序數據(ju)（比(bi)如(ru)，癌(ai)癥(zheng)基因組(zu)圖譜）以便(bian)(bian)從(cong)現存(cun)的(de)數據(ju)中(zhong)找出(chu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)如(ru)何相互作用和一定程(cheng)度上利(li)用細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)重(zhong)建大塊腫瘤(liu)(liu)(liu)樣品的(de)整體行為。
在(zai)一篇發(fa)表(biao)在(zai)國(guo)際學術(shu)期刊Nature Communication上的文章中(zhong)，來自美(mei)國(guo)的科(ke)學家們對(dui)109名(ming)胰腺導(dao)管腺癌（PDA）病人進行了全外(wai)顯子測序，發(fa)現了PDA中(zhong)的基因突變多(duo)樣性，并(bing)且(qie)為發(fa)現PDA治療靶(ba)點提供(gong)了重要信息。
在(zai)該(gai)項研(yan)究中，研(yan)究人員為方便檢(jian)測(ce)基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)，同(tong)時移除非(fei)腫(zhong)瘤性(xing)(xing)組織的(de)(de)(de)污染(ran)，他們利用顯(xian)微切(qie)(qie)割的(de)(de)(de)方法將癌癥患(huan)者的(de)(de)(de)腫(zhong)瘤組織進行了異種移植并建立了細胞(bao)系。隨(sui)后對109例(li)進行過顯(xian)微切(qie)(qie)割的(de)(de)(de)PDA病例(li)進行了全(quan)外顯(xian)子測(ce)序(xu)，經過顯(xian)微切(qie)(qie)割操作后，腫(zhong)瘤細胞(bao)得到富(fu)集(ji)并增強了對基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)。研(yan)究人員通過分析發現(xian)導致(zhi)PDA發生的(de)(de)(de)病因(yin)事(shi)件與腫(zhong)瘤突(tu)變(bian)譜具(ju)有明顯(xian)相關性(xing)(xing)。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在歐洲(zhou)泌尿外(wai)科協(xie)會的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)公布(bu)的(de)(de)一項最新(xin)研(yan)究(jiu)(jiu)成果(guo)中，研(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)對(dui)64份前列腺(xian)組織樣(yang)本進行(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)，對(dui)每一種(zhong)樣(yang)本中的(de)(de)2億個(ge)序列進行(xing)閱讀分析，結果(guo)研(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)發(fa)現(xian)在腫瘤和控制樣(yang)本中有(you)(you)超(chao)過2000個(ge)基因(yin)都表現(xian)出了明顯的(de)(de)差異性，其(qi)中有(you)(you)些相比已知(zhi)的(de)(de)前列腺(xian)癌標(biao)志物而(er)言表現(xian)出了較高的(de)(de)特(te)異性和敏感性;其(qi)中一種(zhong)名為TAPIR的(de)(de)非編碼RNAs則(ze)可以(yi)有(you)(you)效抑制癌細胞的(de)(de)生長，盡管其(qi)可以(yi)轉(zhuan)化(hua)為臨床有(you)(you)用(yong)的(de)(de)治療靶點還為時尚(shang)早。
研究(jiu)者(zhe)在前列(lie)腺(xian)(xian)癌患者(zhe)的(de)尿(niao)液中發現了這些生物標(biao)志物，檢測結果(guo)顯(xian)示其可(ke)以幫(bang)助進行準確的(de)前列(lie)腺(xian)(xian)癌檢測，基于(yu)(yu)相(xiang)關研究(jiu)結果(guo)，研究(jiu)人員(yuan)決(jue)定開發一種進行前列(lie)腺(xian)(xian)癌早期診斷的(de)高(gao)特異性(xing)及敏感(gan)性(xing)的(de)，且基于(yu)(yu)尿(niao)液的(de)檢測手(shou)段;這種檢測方法基于(yu)(yu)對多個生物標(biao)志物的(de)組合，相(xiang)比單(dan)一標(biao)志物而(er)言將表現出較高(gao)的(de)特異性(xing)。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在(zai)一(yi)篇(pian)發(fa)(fa)表于Nature雜志上的(de)(de)報道中，來(lai)自伯(bo)明翰(han)大學的(de)(de)研究人(ren)(ren)員解釋了(le)如(ru)何利用基(ji)(ji)因組測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)技術來(lai)快(kuai)速(su)實現對(dui)疾病暴發(fa)(fa)的(de)(de)有(you)效監測(ce)(ce);文章中他們開發(fa)(fa)了(le)一(yi)種(zhong)手提箱(xiang)式(shi)的(de)(de)基(ji)(ji)因組測(ce)(ce)序(xu)“實驗室”，其中包含(han)有(you)一(yi)種(zhong)新型的(de)(de)DNA測(ce)(ce)序(xu)儀，最(zui)初該設(she)備用于2015年4月在(zai)幾內亞對(dui)埃博拉(la)病人(ren)(ren)的(de)(de)樣本進行檢測(ce)(ce)。
這(zhe)(zhe)項研(yan)究(jiu)中(zhong)，研(yan)究(jiu)人員利(li)用(yong)這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式(shi)(shi)的(de)(de)DNA測(ce)序(xu)儀在整個基(ji)因組(zu)庫(ku)中(zhong)鑒別出了新型的(de)(de)單核苷(gan)酸多(duo)態性（SNPs），目前當測(ce)序(xu)工作局限(xian)于(yu)實驗室的(de)(de)時候，這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式(shi)(shi)機(ji)器的(de)(de)開發對(dui)于(yu)有效進行疾病暴發的(de)(de)監(jian)測(ce)而言(yan)非(fei)常重要，研(yan)究(jiu)者們還希望(wang)可以將這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式(shi)(shi)的(de)(de)機(ji)器應用(yong)于(yu)別的(de)(de)領域(yu)的(de)(de)研(yan)究(jiu)中(zhong)，比如癌癥研(yan)究(jiu)等。
在另外(wai)一(yi)項研究中(zhong)，來自英國牛津大學和巴西(xi)Evandro Chagas研究所等機(ji)構的(de)(de)研究人(ren)員對巴西(xi)的(de)(de)寨卡(ka)病毒(du)暴發進行首個基(ji)因組分析，從而(er)提供關于這種病毒(du)如何和何時可能進入美洲方面的(de)(de)新信息(xi)。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用的(de)是(shi)直接測(ce)序(xu)法(fa)(fa)。1977年(nian)，Frederick Sanger 等發明了雙脫氧鏈(lian)末(mo)端終止(zhi)(zhi)法(fa)(fa)，這一(yi)技(ji)術隨后成為最(zui)為常(chang)用的(de)基(ji)因測(ce)序(xu)技(ji)術。2001 年(nian)，Allan Maxam 和(he) Walter Gibert 發 明了 Sanger 測(ce)序(xu)法(fa)(fa)，并在(zai)此后的(de) 10 年(nian)里成為基(ji)因檢測(ce)的(de)金標準。其基(ji)本(ben)原理即雙脫氧核(he)苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺(que)乏PCR 延伸所需的(de) 3'-OH，因此每(mei)當 DNA 鏈(lian)加(jia)入分子 ddNTP，延伸便(bian)終止(zhi)(zhi)。每(mei)一(yi)次 DNA 測(ce)序(xu)是(shi)由 4個(ge)獨立的(de)反(fan)應(ying)(ying)組成，將模板、引物和(he) 4 種含(han)有不同(tong)的(de)放(fang)射(she)性同(tong)位素(su)標記的(de)核(he)苷酸的(de) ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成長短不一(yi)的(de)片(pian)段(duan)，大量起始點(dian)相同(tong)、終止(zhi)(zhi)點(dian)不同(tong)的(de) DNA 片(pian)段(duan)存(cun)在(zai)于反(fan)應(ying)(ying)體系中，具有單個(ge)堿(jian)基(ji)差別的(de) DNA 序(xu)列可以被聚丙(bing)烯酰(xian)胺變性凝(ning)膠電泳分離出(chu)來，得(de)到(dao)放(fang)射(she)性同(tong)位素(su)自顯影條帶。依據(ju)電泳條帶讀取 DNA 雙鏈(lian)的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)列。
人(ren)類基(ji)(ji)因(yin)(yin)組的(de)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)正是(shi)基(ji)(ji)于該(gai)技(ji)術完成(cheng)的(de)。Sanger 測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)這種直接(jie)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)方法具(ju)有高度的(de)準確性和(he)簡單、快(kuai)捷等特點(dian)。目前，依(yi)然對(dui)于一些臨床上小樣本遺(yi)傳疾病基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)鑒定具(ju)有很高的(de)實用(yong)價值(zhi)(zhi)。例如，臨床上采用(yong) Sanger 直接(jie)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu) FGFR 2 基(ji)(ji)因(yin)(yin)證實單基(ji)(ji)因(yin)(yin) Apert 綜合征和(he)直接(jie)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu) TCOF1 基(ji)(ji)因(yin)(yin)可(ke)(ke)以檢出(chu)多達 90% 的(de)與(yu) Treacher Collins 綜合征相關的(de)突變。值(zhi)(zhi)得注意的(de)是(shi)，Sanger 測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)是(shi)針對(dui)已(yi)知致病基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)突變位點(dian)設計(ji)引物，進(jin)行(xing) PCR 直接(jie)擴(kuo)增測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)。單個突變點(dian)的(de)擴(kuo)增包括該(gai)位點(dian)在(zai)(zai)內(nei)的(de)外顯(xian)子片段即可(ke)(ke)，不(bu)必將該(gai)點(dian)所在(zai)(zai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)全部外顯(xian)子都擴(kuo)增。
因(yin)(yin)此，應明確定位要擴增的(de)(de)位點所在(zai)的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)外顯子(zi)和(he)該點的(de)(de)具體(ti)位置，設計包括該點在(zai)內的(de)(de)上下(xia)游 150 ~ 200 bp 的(de)(de)外顯子(zi)片段(duan)引物。此外，盡管有NGS 的(de)(de)出現，但 Sanger 測(ce)(ce)序對于有致病基(ji)因(yin)(yin)位點明確并且(qie)數量(liang)有限(xian)的(de)(de)單基(ji)因(yin)(yin)遺傳疾病的(de)(de)致病基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)檢(jian)測(ce)(ce)是非常經(jing)濟和(he)高(gao)效的(de)(de)。到目前為止(zhi)，Sanger 測(ce)(ce)序仍然是作為基(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)金標(biao)準，也是 NGS 基(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)(ce)后(hou)進行(xing)家系內和(he)正常對照組(zu)驗證的(de)(de)主要手(shou)段(duan)。
值得注意的(de)(de)是(shi)(shi)，Sanger 測(ce)序(xu)目(mu)的(de)(de)是(shi)(shi)尋找與疾病有關的(de)(de)特定(ding)(ding)的(de)(de)基因(yin)(yin)突變(bian)。對(dui)于(yu)沒有明確(que)候(hou)選(xuan)基因(yin)(yin)或(huo)候(hou)選(xuan)基因(yin)(yin)數量(liang)較多的(de)(de)大樣本病例篩查是(shi)(shi)難以(yi)完(wan)成(cheng)的(de)(de)，此類(lei)(lei)測(ce)序(xu)研究還(huan)要依靠具(ju)有高(gao)(gao)通(tong)量(liang)測(ce)序(xu)能力的(de)(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)序(xu)具(ju)有高(gao)(gao)度的(de)(de)分(fen)析(xi)準確(que)性，但其準確(que)性還(huan)取決(jue)于(yu)測(ce)序(xu)儀器(qi)以(yi)及測(ce)序(xu)條件的(de)(de)設定(ding)(ding)。另(ling)外，Sanger 測(ce)序(xu)不能檢測(ce)出大片段缺失或(huo)拷貝數變(bian)異等基因(yin)(yin)突變(bian)的(de)(de)類(lei)(lei)型，因(yin)(yin)此對(dui)于(yu)一些與此相(xiang)關的(de)(de)遺(yi)傳(chuan)性疾病還(huan)不能做(zuo)出基因(yin)(yin)學診(zhen)斷。
1.2 連鎖分析
采用的(de)(de)(de)是(shi)間(jian)(jian)接測序(xu)(xu)法。在(zai) NGS 出現之前，國(guo)際通(tong)用的(de)(de)(de)疾病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)(wei)克隆(long)策略是(shi)建立在(zai)大規模全基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)掃(sao)描和連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)分析(xi)(xi)基(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)上的(de)(de)(de)位(wei)(wei)置(zhi)候(hou)選基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)克隆(long)。人類的(de)(de)(de)染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)成對出現，一(yi)(yi)條來自父(fu)(fu)親，一(yi)(yi)條來自母親，每一(yi)(yi)對染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)在(zai)同樣的(de)(de)(de)位(wei)(wei)置(zhi)上擁(yong)有(you)相同的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，但是(shi)其序(xu)(xu)列(lie)并不(bu)完全相同，被稱為(wei)父(fu)(fu)系(xi)(xi)和母系(xi)(xi)等(deng)位(wei)(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記是(shi)指(zhi)在(zai)人群(qun)中表現出多態(tai)現象(xiang)(xiang)的(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)，可(ke)(ke)追蹤染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)、染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)某(mou)(mou)一(yi)(yi)節段或(huo)某(mou)(mou)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)座在(zai)家系(xi)(xi)中傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)遞的(de)(de)(de)任何一(yi)(yi)種遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)特性(xing)(xing)(xing)。它存(cun)在(zai)于每一(yi)(yi)個(ge)人，但大小和序(xu)(xu)列(lie)有(you)差(cha)別，具有(you)可(ke)(ke)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)和可(ke)(ke)識別性(xing)(xing)(xing)。目前采用第二代遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記，即重復序(xu)(xu)列(lie)多態(tai)性(xing)(xing)(xing)，特別是(shi)短串聯重復序(xu)(xu)列(lie)，又(you)稱微衛(wei)星標(biao)記。連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)分析(xi)(xi)是(shi)以(yi)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)這種遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)現象(xiang)(xiang)為(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)，研究(jiu)致病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)與(yu)(yu)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)標(biao)記之間(jian)(jian)關系(xi)(xi)的(de)(de)(de)方法。如(ru)果控制某(mou)(mou)一(yi)(yi)表型性(xing)(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)附近存(cun)在(zai)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記，那么(me)利(li)用某(mou)(mou)個(ge)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記與(yu)(yu)某(mou)(mou)個(ge)擬定(ding)(ding)位(wei)(wei)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)之間(jian)(jian)是(shi)否(fou)存(cun)在(zai)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)關系(xi)(xi)，以(yi)及連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)的(de)(de)(de)緊密(mi)程(cheng)度就能將該基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)(wei)到染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)某(mou)(mou)一(yi)(yi)位(wei)(wei)置(zhi)上。1986 年 Morton 等(deng)提出優勢對數(shu)記分法（og odds score method，LOD），主要檢測兩基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)以(yi)某(mou)(mou)一(yi)(yi)重組率連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)時(shi)的(de)(de)(de)似(si)然性(xing)(xing)(xing)。LOD 值為(wei)正，支持連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)；LOD 值為(wei)負，則否(fou)定(ding)(ding)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)。通(tong)過計算(suan)家系(xi)(xi)中的(de)(de)(de)微衛(wei)星標(biao)記與(yu)(yu)致病位(wei)(wei)點之間(jian)(jian)的(de)(de)(de) LOD 值，可(ke)(ke)以(yi)初步估算(suan)二者(zhe)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)距離及連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)程(cheng)度，從而確定(ding)(ding)該基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)上的(de)(de)(de)粗略位(wei)(wei)置(zhi)。然后利(li)用該區域(yu)(yu)的(de)(de)(de)染(ran)(ran)色(se)(se)體(ti)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)圖譜，分析(xi)(xi)定(ding)(ding)位(wei)(wei)區域(yu)(yu)內所有(you)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)功能與(yu)(yu)表達，選擇合適的(de)(de)(de)候(hou)選基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)進行突變檢測，最終將致病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)(wei)或(huo)克隆(long)。
然而，采用(yong)連鎖分析(xi)進行基因(yin)檢測(ce)存在(zai)很大的局限性。不但所需遺(yi)傳樣本量較(jiao)大，一(yi)般要求提供(gong)三代(dai)及(ji)以(yi)上遺(yi)傳家(jia)(jia)系(xi)患者(zhe)血(xue)樣，而且數據量大、處理復(fu)雜(za)、產出速度較(jiao)慢、定(ding)位不夠精確（一(yi)般只能定(ding)位在(zai)染(ran)色(se)體某(mou)一(yi)區間），這就(jiu)使(shi)得研(yan)究(jiu)工作(zuo)繁重和定(ding)位基因(yin)的時(shi)間周期特別長(chang)。目(mu)前，連鎖分析(xi)采用(yong)的單(dan)核苷酸多肽性和短串(chuan)聯重復(fu)序(xu)列還在(zai)使(shi)用(yong)，但經(jing)典的間接測(ce)序(xu)方法，如(ru)單(dan)鏈構象多肽性、變性梯度凝膠(jiao)電泳和異源雙鏈分析(xi)在(zai)美國(guo)已(yi)被淘汰，而在(zai)發(fa)展(zhan)中國(guo)家(jia)(jia)作(zuo)為研(yan)究(jiu)手段還在(zai)有限使(shi)用(yong)。
2、新一代測序（NGS）
主 要 包(bao) 括 全(quan) 基(ji) 因 組(zu) 重 測(ce) 序（whole-genomesequencing，WGS）、全(quan)外顯子組(zu)測(ce)序（whole-exomesequencing，WES）和(he)目標區域測(ce)序（Targeted regionssequencing，TRS），它們(men)同屬于新一代測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)。總(zong)體而(er)言，NGS 技(ji)(ji)術(shu)具有(you)通量大(da)、時間(jian)短、精確度高(gao)和(he)信息量豐富(fu)等(deng)(deng)優點，使(shi)得遺(yi)傳學者可以(yi)(yi)在短時間(jian)內對感興趣的基(ji)因進(jin)行(xing)精確定(ding)位。但這些不(bu)同的測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)在測(ce)序范圍、數據分(fen)析量以(yi)(yi)及(ji)測(ce)序費(fei)用和(he)時間(jian)等(deng)(deng)方(fang)面又有(you)很大(da)差別，如果(guo)選擇適合的方(fang)法，對于臨床診斷和(he)科學研究將起到(dao)事(shi)半(ban)功(gong)倍(bei)的作(zuo)用。
2.1 目標區域測序
目(mu)(mu)(mu)前常(chang)用(yong)的(de)是基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯片(pian)(pian)技(ji)術。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)原理是基(ji)(ji)于 DNA 雜交(jiao)原理，利用(yong)目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)區(qu)(qu)域(yu)(yu)定(ding)制(zhi)的(de)探針(zhen)與(yu)(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu) DNA 進(jin)(jin)(jin)行芯片(pian)(pian)雜交(jiao)或溶(rong)液雜交(jiao)，將目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)區(qu)(qu)域(yu)(yu) DNA 富集，再(zai)通過(guo)(guo)NGS 技(ji)術進(jin)(jin)(jin)行測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)過(guo)(guo)程是通過(guo)(guo)把數以(yi)萬計的(de) cDNA 或寡聚核苷酸(suan)(suan)置于芯片(pian)(pian)上(shang)制(zhi)成列(lie)陣，將芯片(pian)(pian)上(shang)固定(ding)好(hao)的(de)已知序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)核苷酸(suan)(suan)探針(zhen)與(yu)(yu)溶(rong)液中含有熒(ying)光標(biao)(biao)記的(de)相應核酸(suan)(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)進(jin)(jin)(jin)行互補配對，根據測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)儀(yi)所顯示強(qiang)熒(ying)光的(de)位置和(he)強(qiang)度，獲取每(mei)組(zu)點(dian)陣列(lie)信(xin)息，再(zai)利用(yong)生物信(xin)息學算(suan)法確(que)定(ding)目(mu)(mu)(mu)的(de)靶核苷酸(suan)(suan)的(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)組(zu)成。測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)所選定(ding)的(de)目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)(qu)域(yu)(yu)可(ke)以(yi)是連續的(de) DNA 序(xu)(xu)(xu)列(lie)，也可(ke)以(yi)是分(fen)布在同一個(ge)染色(se)體不同區(qu)(qu)域(yu)(yu)或不同染色(se)體上(shang)的(de)片(pian)(pian)段。目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)(qu)域(yu)(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)術，對于以(yi)往通過(guo)(guo)連鎖分(fen)析將基(ji)(ji)因(yin)(yin)突變鎖定(ding)在染色(se)體某(mou)一片(pian)(pian)段區(qu)(qu)域(yu)(yu)內(nei)，但(dan)無法找出突變是一個(ge)非常(chang)好(hao)的(de)進(jin)(jin)(jin)一步檢測(ce)(ce)手段。2010 年，Nicholas等(deng)使用(yong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)分(fen)型芯片(pian)(pian)聯合(he)連鎖分(fen)析技(ji)術，成功發現(xian)頭小畸形的(de)新基(ji)(ji)因(yin)(yin) WDR62，文章發表在《NatGenet》雜志。類似(si)的(de)研究在家族性胰腺癌中確(que)定(ding) 8 個(ge)候選變異位點(dian)和(he)在家族性滲出性玻(bo)璃(li)體視網膜病變發現(xian)易感基(ji)(ji)因(yin)(yin) TSPAN12。
基(ji)(ji)因(yin)芯片(pian)測(ce)序技(ji)術可以(yi)將經過連鎖(suo)分析鎖(suo)定(ding)了(le)(le)目(mu)標范圍(wei)(wei)或(huo)經過全(quan)基(ji)(ji)因(yin)組篩(shai)選的(de)(de)(de)特(te)定(ding)基(ji)(ji)因(yin)或(huo)區(qu)域(yu)進行更(geng)深一層(ceng)的(de)(de)(de)研究，是解(jie)決連鎖(suo)分析無(wu)法(fa)發現致病基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)有(you)效手段(duan)。基(ji)(ji)因(yin)芯片(pian)技(ji)術對于已知(zhi)基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)的(de)(de)(de)篩(shai)查(cha)具有(you)明顯優(you)勢，可以(yi)快速、全(quan)面地(di)檢測(ce)出目(mu)標基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)。同時(shi)，由于目(mu)標區(qu)域(yu)受(shou)到了(le)(le)限(xian)制，測(ce)序范圍(wei)(wei)大幅度減少，測(ce)序時(shi)間和(he)費用(yong)相應(ying)降(jiang)低。但基(ji)(ji)因(yin)芯片(pian)檢測(ce)所(suo)需要的(de)(de)(de) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)要大，由于已提(ti)取的(de)(de)(de) DNA 存在降(jiang)解(jie)的(de)(de)(de)風險，用(yong)于基(ji)(ji)因(yin)芯片(pian)研究的(de)(de)(de)血標本最好是冰凍的(de)(de)(de)全(quan)血，這樣可以(yi)使(shi)用(yong)于檢測(ce) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)有(you)充分保證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)組(zu)是(shi)單(dan)個(ge)個(ge)體的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)組(zu) DNA 上所有(you)蛋(dan)白(bai)質編(bian)碼序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)總(zong)合。人(ren)類(lei)外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)組(zu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)約占(zhan)人(ren)類(lei)全部基因(yin)(yin)組(zu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de) 1%，但大(da)約包含 85% 的(de)(de)(de)致病突(tu)變。WES 是(shi)利用(yong)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)捕(bu)獲(huo)(huo)技(ji)術將全外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)區(qu)(qu)域(yu) DNA 捕(bu)捉并富集(ji)后進行高通(tong)量測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)分析方法(fa)。采用(yong)的(de)(de)(de)技(ji)術平臺主要是(shi)羅氏公(gong)(gong)司(si)的(de)(de)(de) SeqCap EZ 全外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)捕(bu)獲(huo)(huo)系統(tong)，Illumina 公(gong)(gong)司(si)的(de)(de)(de) Solexa 技(ji)術和(he) Agilent 公(gong)(gong)司(si)的(de)(de)(de) SureSelect 外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)靶向序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)富集(ji)系統(tong)。其捕(bu)獲(huo)(huo)的(de)(de)(de)目標區(qu)(qu)在 34 ~ 62 M 之(zhi)間，不僅包括編(bian)碼區(qu)(qu)同(tong)時也加入(ru)了部分非(fei)編(bian)碼區(qu)(qu)。NGS 的(de)(de)(de)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)過程主要包括DNA 測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)文庫的(de)(de)(de)制(zhi)備、錨定橋接、PCR 擴增、單(dan)堿基延伸測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)和(he)數據分析。研(yan)究者根據測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)儀捕(bu)獲(huo)(huo)到在測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)過程中摻(chan)入(ru)有(you)不同(tong)熒光標記堿基片段(duan)，經(jing)計算機將熒光信號轉化成(cheng)不同(tong)顏色的(de)(de)(de)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)峰圖和(he)堿基序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。基因(yin)(yin)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)結果與(yu)NCBI的(de)(de)(de)SNP數據庫、千(qian)人(ren)基因(yin)(yin)組(zu)數據庫等(deng)國際權威數據庫比(bi)對，最終(zhong)確定是(shi)否(fou)為突(tu)變基因(yin)(yin)。
自(zi)NGS 技術(shu)問世(shi)以來，利用 WES 在(zai)臨床疾病(bing)(bing)致病(bing)(bing)基(ji)因的(de)(de)鑒定研(yan)究(jiu)(jiu)中取(qu)得(de)前所未有的(de)(de)成(cheng)(cheng)果。這些(xie)(xie)成(cheng)(cheng)果不僅集中在(zai)單基(ji)因遺(yi)傳(chuan)疾病(bing)(bing)，還在(zai)多基(ji)因影響(xiang)的(de)(de)復雜疾病(bing)(bing)中獲得(de)大量相關基(ji)因的(de)(de)發(fa)(fa)(fa)現。在(zai)單基(ji)因遺(yi)傳(chuan)性(xing)疾病(bing)(bing)中，如視網膜色(se)素變(bian)性(xing)、終端骨發(fa)(fa)(fa)育不良(liang)等(deng)發(fa)(fa)(fa)現新基(ji)因或已知基(ji)因新突變(bian)。在(zai)一些(xie)(xie)罕見的(de)(de)疾病(bing)(bing)中，如 Kabuki 綜合征、家(jia)族(zu)性(xing)混(hun)合型(xing)低脂血癥和脊髓小(xiao)腦(nao)共(gong)濟失調癥等(deng)疾病(bing)(bing)中發(fa)(fa)(fa)現新的(de)(de)致病(bing)(bing)基(ji)因。同時(shi)，在(zai)小(xiao)細胞肺(fei)癌(ai)、慢性(xing)淋巴細胞性(xing)白血病(bing)(bing)等(deng)腫瘤研(yan)究(jiu)(jiu)和諸(zhu)如肥(fei)胖(pang)癥、腦(nao)皮質發(fa)(fa)(fa)育不良(liang)等(deng)復雜疾病(bing)(bing)的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)中也取(qu)得(de)豐碩成(cheng)(cheng)果。
WES 技術(shu)在篩(shai)查范圍和(he)(he)(he)檢出率等(deng)方面較(jiao)其他(ta)測序(xu)(xu)(xu)技術(shu)具有(you)(you)明(ming)顯的(de)(de)(de)優勢。例如，對(dui)(dui)于(yu)(yu)(yu)采用(yong) Sanger測序(xu)(xu)(xu)和(he)(he)(he)基因(yin)(yin)芯片測序(xu)(xu)(xu)不(bu)(bu)能篩(shai)查出基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)樣本(ben)，可(ke)以(yi)采用(yong) WES 來進(jin)(jin)一(yi)步基因(yin)(yin)篩(shai)查鑒定(ding)(ding)。應用(yong) WES技術(shu)能夠獲得較(jiao)傳(chuan)統 Sanger 等(deng)方法(fa)對(dui)(dui)編碼(ma)(ma)區(qu)測序(xu)(xu)(xu)更(geng)深的(de)(de)(de)覆(fu)蓋度和(he)(he)(he)更(geng)準確的(de)(de)(de)數(shu)據。由于(yu)(yu)(yu)信息量的(de)(de)(de)大(da)幅度增加(jia)，WES 可(ke)以(yi)獲得更(geng)多(duo)個(ge)體的(de)(de)(de)編碼(ma)(ma)區(qu)信息，因(yin)(yin)此成(cheng)為(wei)檢測致(zhi)病(bing)(bing)(bing)基因(yin)(yin)和(he)(he)(he)易感基因(yin)(yin)位(wei)點的(de)(de)(de)有(you)(you)效手(shou)段。與連(lian)鎖分析定(ding)(ding)位(wei)方法(fa)比較(jiao)，WES 對(dui)(dui)家(jia)系的(de)(de)(de)要(yao)求并(bing)不(bu)(bu)十(shi)分嚴(yan)格，在單(dan)基因(yin)(yin)遺(yi)(yi)傳(chuan)病(bing)(bing)(bing)同一(yi)家(jia)系中有(you)(you) 2 ~3 個(ge)患者和(he)(he)(he) 1 個(ge)正常人即(ji)可(ke)進(jin)(jin)行致(zhi)病(bing)(bing)(bing)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)鑒定(ding)(ding)研究(jiu)，而不(bu)(bu)需(xu)要(yao)連(lian)續(xu)三(san)代的(de)(de)(de)遺(yi)(yi)傳(chuan)家(jia)系。由于(yu)(yu)(yu)不(bu)(bu)需(xu)要(yao)嚴(yan)格的(de)(de)(de)三(san)代以(yi)上的(de)(de)(de)遺(yi)(yi)傳(chuan)家(jia)系，WES 使以(yi)前不(bu)(bu)能進(jin)(jin)行研究(jiu)的(de)(de)(de)家(jia)系成(cheng)為(wei)可(ke)能。不(bu)(bu)僅對(dui)(dui)于(yu)(yu)(yu)單(dan)基因(yin)(yin)遺(yi)(yi)傳(chuan)病(bing)(bing)(bing)是一(yi)個(ge)很好(hao)的(de)(de)(de)研究(jiu)手(shou)段，對(dui)(dui)于(yu)(yu)(yu)許(xu)多(duo)常見病(bing)(bing)(bing)，如腫瘤、糖尿(niao)病(bing)(bing)(bing)等(deng)疾病(bing)(bing)(bing)也可(ke)進(jin)(jin)行大(da)規模比較(jiao)研究(jiu)。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
