一、培養基配制方法
培養基是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養料,一般是根據配方配制而成的,配方沒有特殊要求的話,一般培養基的配制(zhi)方法步驟如下(xia):
1、配料
配方換算→在容器中加入少量水(shui)(蒸餾水(shui),自然水(shui))→按照配方稱取(qu)各(ge)種(zhong)藥(yao)品(依次加入)→加足所需水(shui)量(一藥(yao)一勺(shao),取(qu)藥(yao)后立即蓋上瓶蓋)。
2、溶解
淀(dian)粉溶解:少量冷水調成(cheng)糊狀(zhuang)。
加(jia)熱(re)溶解(jie),特別(bie)是加(jia)有瓊(qiong)脂的培養基,一定要煮沸(fei),瓊(qiong)脂的熔解(jie)溫(wen)度(du)95-97℃ ,且需要邊(bian)加(jia)熱(re)邊(bian)攪拌以防止燒焦(jiao)。
3、調PH
用1N的(de)鹽(yan)酸(suan)或1N的(de) NaOH把培養基(ji)調節到所要求的(de)值。
4、過濾
濾紙或棉花進行過濾。(有時可(ke)以(yi)省去)
5、分裝
一般(ban)培養基放在三角瓶(ping)或試管中滅菌使用。
(1)三角瓶
若(ruo)作(zuo)靜置培(pei)養,則100ml培(pei)養基(ji)/250ml的(de)三角瓶(ping),最多不能超過150ml培(pei)養基(ji)/250ml的(de)三角瓶(ping),否則滅(mie)菌時培(pei)養基(ji)沸騰(teng)容(rong)易污染(ran)棉(mian)塞,造(zao)成(cheng)染(ran)菌;若(ruo)作(zuo)搖瓶(ping)培(pei)養,則15-20ml培(pei)養基(ji)/250ml的(de)三角瓶(ping),保證通氣(qi)良好。
(2)試管分裝
液體培養基一(yi)般裝4-5ml,約試(shi)管(guan)的1/4高度(du);固體斜面培養基一(yi)般裝3-4ml,約試(shi)管(guan)的1/5高度(du)。
6、包扎
分(fen)裝(zhuang)好后,塞(sai)上棉(mian)塞(sai),在用(yong)牛皮紙將棉(mian)塞(sai)包裹好,防(fang)止(zhi)滅菌時水(shui)份進入把棉(mian)塞(sai)弄(nong)濕。
7、滅菌
按配方(fang)上要(yao)求的溫度(du)、壓力(li)進行高壓蒸汽(qi)滅(mie)菌(jun)。如果滅(mie)菌(jun)的溫度(du)太高,營(ying)養(yang)成(cheng)分會被破(po)壞,培(pei)養(yang)基中的糖(tang)、氨(an)基酸會使培(pei)養(yang)基的顏色變深(shen)。
8、擺斜面
滅菌后需要擺斜面的(de)試(shi)管要趁熱斜著擺放,使(shi)其凝(ning)固成(cheng)為一個斜面,約占試(shi)管長(chang)度的(de)1/2。
9、貯存
培(pei)養(yang)基在30℃下放置(zhi)一(yi)天(tian),無污染的即可使用。一(yi)般用牛皮紙包裹好存放于2-8℃冰箱中備用。
二、培養基配制注意事項
1、分裝(zhuang)好(hao)的培養(yang)基(ji)應當天進行滅菌處理(2小時內滅菌最佳),分裝(zhuang)的量不宜(yi)超過容器的2/3以(yi)免(mian)滅菌時外溢。
2、實驗室采用(yong)濕熱(re)滅(mie)(mie)(mie)菌(jun)對培養(yang)基(ji)進(jin)行滅(mie)(mie)(mie)菌(jun)處理,按照培養(yang)基(ji)使用(yong)說明采用(yong)合(he)適的滅(mie)(mie)(mie)菌(jun)溫度(du)和時(shi)間。尤其含糖(tang)量(liang)較高(gao)(gao)的培養(yang)基(ji)溫度(du)不應太高(gao)(gao),過高(gao)(gao)會(hui)導致糖(tang)分焦化,影響質量(liang)。
3、每次制(zhi)備培(pei)養基(ji)均(jun)應(ying)有配制(zhi)記(ji)(ji)(ji)錄,記(ji)(ji)(ji)錄應(ying)復(fu)制(zhi)一(yi)份,原記(ji)(ji)(ji)錄保(bao)存備查,復(fu)制(zhi)記(ji)(ji)(ji)錄隨制(zhi)好(hao)的培(pei)養基(ji)一(yi)同存放、以防發生混(hun)亂。
4、培(pei)養(yang)基應存放于冷(leng)暗處,最好(hao)放于普通冰(bing)箱(xiang)內(nei)。放置時(shi)間(jian)不(bu)宜(yi)超(chao)過一(yi)周,傾注的(de)平板培(pei)養(yang)基不(bu)宜(yi)超(chao)過3天。每批培(pei)養(yang)基均必須附(fu)有該批培(pei)養(yang)基制備記錄(lu)副頁(ye)或(huo)明顯標(biao)簽。
三、培養基的配制原則有哪些
培養(yang)基的配制除了(le)要注(zhu)意(yi)(yi)正確的方(fang)法以及一些注(zhu)意(yi)(yi)事項外(wai),還要注(zhu)意(yi)(yi)遵循(xun)以下幾個原則:
1、選擇適宜的營養物質
總體而(er)言,所有微(wei)生物(wu)生長繁殖均需(xu)要(yao)培養(yang)基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因(yin)子、水及能源,但由于微(wei)生物(wu)營(ying)養(yang)類型復雜,不同微(wei)生物(wu)對營(ying)養(yang)物(wu)質的(de)需(xu)求(qiu)(qiu)是不一(yi)樣(yang)的(de),因(yin)此首先要(yao)根據不同微(wei)生物(wu)的(de)營(ying)養(yang)需(xu)求(qiu)(qiu)配制針(zhen)對性強的(de)培養(yang)基。
就(jiu)微生(sheng)物(wu)主要類型而(er)言,有細菌(jun)、放線菌(jun)、酵母(mu)菌(jun)、霉菌(jun)、原(yuan)生(sheng)動物(wu)、藻類及病毒(du)之分,培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)它們所需的培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基各(ge)不相同。在實(shi)驗室中常用(yong)牛(niu)肉膏(gao)蛋白胨(dong)培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基(或簡稱普通肉湯培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基)培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)細菌(jun),用(yong)高氏I號合(he)成培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)放線菌(jun),培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)酵母(mu)菌(jun)一般(ban)(ban)用(yong)麥(mai)芽汁培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基,培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)霉菌(jun)則一般(ban)(ban)用(yong)查氏合(he)成培養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基。
2、營養物質濃度及配比合適
培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)營養(yang)物(wu)質(zhi)濃(nong)度(du)合適時微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)才能(neng)(neng)生(sheng)(sheng)長(chang)良好,營養(yang)物(wu)質(zhi)濃(nong)度(du)過低時不能(neng)(neng)滿足微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)正常生(sheng)(sheng)長(chang)所(suo)需(xu),濃(nong)度(du)過高(gao)時則可能(neng)(neng)對(dui)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)長(chang)起抑(yi)制作用。另(ling)外,培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)各營養(yang)物(wu)質(zhi)之(zhi)間的(de)(de)濃(nong)度(du)配比(bi)也直接(jie)影(ying)響微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)生(sheng)(sheng)長(chang)繁殖和(或)代(dai)謝(xie)產物(wu)的(de)(de)形成(cheng)和積累,其中(zhong)碳氮比(bi)(C/N)的(de)(de)影(ying)響較(jiao)大(da)。嚴格(ge)地講(jiang),碳氮比(bi)指(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)碳元素與(yu)氮元素的(de)(de)物(wu)質(zhi)的(de)(de)量(liang)比(bi)值(zhi),有時也指(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)還原糖與(yu)粗蛋白之(zhi)比(bi)。
3、控制pH條件
培養(yang)基(ji)的(de)(de)pH必須控制(zhi)在(zai)(zai)(zai)(zai)一定的(de)(de)范圍(wei)內(nei),以滿足不同(tong)類型微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)繁(fan)(fan)殖或產(chan)(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)代(dai)(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)。各(ge)類微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)繁(fan)(fan)殖或產(chan)(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)代(dai)(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)的(de)(de)最適pH條(tiao)件各(ge)不相同(tong),一般來講,細菌(jun)與放線菌(jun)適于在(zai)(zai)(zai)(zai)pH7-7.5范圍(wei)內(nei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang),酵母菌(jun)和霉(mei)菌(jun)通常在(zai)(zai)(zai)(zai)pH4.5-6范圍(wei)內(nei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)。值得注意的(de)(de)是,在(zai)(zai)(zai)(zai)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)繁(fan)(fan)殖和代(dai)(dai)謝過程中,由于營養(yang)物(wu)質被分解(jie)利用(yong)和代(dai)(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)的(de)(de)形成與積累,會導致培養(yang)基(ji)pH發生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)變化(hua),若不對培養(yang)基(ji)pH條(tiao)件進行控制(zhi),往往導致微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)速度下(xia)降或(和)代(dai)(dai)謝產(chan)(chan)物(wu)產(chan)(chan)量(liang)下(xia)降。因此(ci),為了維持培養(yang)基(ji)pH的(de)(de)相對恒(heng)定,通常在(zai)(zai)(zai)(zai)培養(yang)基(ji)中加入pH緩沖劑。
4、控制氧化還原電位
不同(tong)類(lei)型微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)長對氧(yang)化還原電位(F)的(de)要求不一(yi)(yi)樣,一(yi)(yi)般好氧(yang)性(xing)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)在(zai)F值(zhi)為(wei)+0.1V以(yi)上時可(ke)正常生(sheng)(sheng)長,一(yi)(yi)般以(yi)+0.3—+0.4V為(wei)宜,厭(yan)(yan)氧(yang)性(xing)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)只能在(zai)F值(zhi)低于+0.1V條(tiao)件下生(sheng)(sheng)長,兼(jian)性(xing)厭(yan)(yan)氧(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)在(zai)F值(zhi)為(wei)+0.1V以(yi)上時進行(xing)好氧(yang)呼吸,在(zai)+0.1V以(yi)下時進行(xing)發酵(jiao)。F值(zhi)與(yu)氧(yang)分壓和pH有關,也受某些(xie)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)代謝產(chan)物(wu)(wu)的(de)影響。在(zai)pH相對穩定的(de)條(tiao)件下,可(ke)通(tong)過增(zeng)加(jia)(jia)通(tong)氣量(如振蕩培(pei)(pei)養、攪拌(ban))提(ti)高(gao)培(pei)(pei)養基的(de)氧(yang)分壓,或加(jia)(jia)入氧(yang)化劑(ji),從(cong)而增(zeng)加(jia)(jia)F值(zhi);在(zai)培(pei)(pei)養基中加(jia)(jia)入抗壞(huai)血酸、硫(liu)(liu)化氫、半胱氨酸、谷(gu)胱甘肽、二硫(liu)(liu)蘇糖醇等(deng)還原性(xing)物(wu)(wu)質可(ke)降低F值(zhi)。
5、原料來源的選擇
在(zai)配制(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)時,應盡量(liang)利(li)用(yong)廉價(jia)且易于獲(huo)得的(de)(de)(de)原料(liao)作(zuo)(zuo)(zuo)為培(pei)養(yang)基(ji)成分,特別是在(zai)發(fa)酵(jiao)(jiao)工(gong)業(ye)中(zhong)(zhong),培(pei)養(yang)基(ji)用(yong)量(liang)很大(da),利(li)用(yong)低(di)成本(ben)的(de)(de)(de)原料(liao)更體現出其經濟價(jia)值(zhi)。例如(ru)(ru),在(zai)微生(sheng)(sheng)物單細(xi)胞蛋白(bai)(bai)的(de)(de)(de)工(gong)業(ye)生(sheng)(sheng)產(chan)過程(cheng)中(zhong)(zhong),常常利(li)用(yong)糖(tang)蜜(制(zhi)糖(tang)工(gong)業(ye)中(zhong)(zhong)含有(you)蔗糖(tang)的(de)(de)(de)廢(fei)(fei)液(ye))、乳(ru)清(乳(ru)制(zhi)品(pin)工(gong)業(ye)中(zhong)(zhong)含有(you)乳(ru)糖(tang)的(de)(de)(de)廢(fei)(fei)液(ye))、豆制(zhi)品(pin)工(gong)業(ye)廢(fei)(fei)液(ye)及(ji)黑廢(fei)(fei)液(ye)(造紙工(gong)業(ye)中(zhong)(zhong)含有(you)戊(wu)糖(tang)和己糖(tang)的(de)(de)(de)亞硫酸紙漿)等(deng)都可作(zuo)(zuo)(zuo)為培(pei)養(yang)基(ji)的(de)(de)(de)原料(liao)。再如(ru)(ru),工(gong)業(ye)上的(de)(de)(de)甲烷發(fa)酵(jiao)(jiao)主要利(li)用(yong)廢(fei)(fei)水、廢(fei)(fei)渣作(zuo)(zuo)(zuo)原料(liao),而在(zai)我國農村,已推廣利(li)用(yong)人畜糞(fen)便及(ji)禾草為原料(liao)發(fa)酵(jiao)(jiao)生(sheng)(sheng)產(chan)甲烷作(zuo)(zuo)(zuo)為燃料(liao)。另外,大(da)量(liang)的(de)(de)(de)農副產(chan)品(pin)或制(zhi)品(pin),如(ru)(ru)鼓皮(pi)、米(mi)糠、玉米(mi)漿、酵(jiao)(jiao)母浸膏、酒糟(zao)、豆餅、花生(sheng)(sheng)餅、蛋白(bai)(bai)胨等(deng)都是常用(yong)的(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)(jiao)工(gong)業(ye)原料(liao)。
6、滅菌處理
要獲得微生物純培養,必須避免雜菌污染,因此對所用器材及工作場所進行消毒與滅菌。對培養基而言,更是要進行嚴格的滅菌。對培養基一般采取高壓蒸汽滅菌,一般培養基用1.05kg/cm2,121.3℃條件下維(wei)持15-30min可達到滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)目的(de)(de)。在高(gao)壓(ya)蒸汽(qi)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)過程中(zhong),長時(shi)間(jian)高(gao)溫會(hui)使某(mou)些不耐熱物(wu)質(zhi)(zhi)遭到破壞(huai),如使糖(tang)類物(wu)質(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)氨基(ji)糖(tang)、焦糖(tang),因此含(han)糖(tang)培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)常(chang)在0.56kg/cm2,112.6℃15-30分鐘進行滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun),某(mou)些對糖(tang)類要(yao)求(qiu)較高(gao)的(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji),可先(xian)將(jiang)糖(tang)進行過濾(lv)除菌(jun)(jun)(jun)(jun)或(huo)間(jian)歇滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun),再(zai)(zai)與其(qi)他已滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)成(cheng)分混合(he);長時(shi)間(jian)高(gao)溫還(huan)會(hui)引(yin)起磷酸(suan)鹽、碳酸(suan)鹽與某(mou)些陽離子(特別(bie)是鈣、鎂、鐵(tie)離子)結(jie)合(he)形(xing)成(cheng)難溶(rong)性(xing)復合(he)物(wu)而產生沉(chen)淀(dian),因此,在配制用(yong)(yong)于(yu)觀察和定(ding)量(liang)測(ce)定(ding)微生物(wu)生長狀況(kuang)的(de)(de)合(he)成(cheng)培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)時(shi),常(chang)需在培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)加入(ru)少(shao)量(liang)螯合(he)劑,避免培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)產生沉(chen)淀(dian),常(chang)用(yong)(yong)的(de)(de)螯合(he)劑為乙二胺(an)四(si)乙酸(suan)(EDTA)。還(huan)可以(yi)將(jiang)含(han)鈣、鎂、鐵(tie)等(deng)離子的(de)(de)成(cheng)分與磷酸(suan)鹽、碳酸(suan)鹽分別(bie)進行滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun),然(ran)后再(zai)(zai)混合(he),避免形(xing)成(cheng)沉(chen)淀(dian);高(gao)壓(ya)蒸汽(qi)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)后,培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)pH會(hui)發(fa)生改變(一般使pH降低),可根據(ju)所培(pei)(pei)(pei)養(yang)微生物(wu)的(de)(de)要(yao)求(qiu),在培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)前后加以(yi)調整。
在配制(zhi)培養基(ji)(ji)過(guo)程中,泡(pao)沫(mo)的(de)存在對滅(mie)(mie)菌處理(li)極不利,因為泡(pao)沫(mo)中的(de)空(kong)氣(qi)形成(cheng)隔(ge)熱層,使泡(pao)沫(mo)中微生(sheng)物難以被殺死(si)。因而有(you)時需要在培養基(ji)(ji)中加入消泡(pao)沫(mo)劑以減少(shao)泡(pao)沫(mo)的(de)產生(sheng),或適當提高(gao)滅(mie)(mie)菌溫度(du)。