一、膠原酶簡介

膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶按其存在的(de)(de)(de)方式不(bu)同可分(fen)為人體(ti)內(nei)源(yuan)性(xing)(xing)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶和藥(yao)用(yong)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶兩(liang)種(zhong)。人體(ti)內(nei)源(yuan)性(xing)(xing)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶是(shi)指人體(ti)內(nei)部(bu)本身所(suo)具有的(de)(de)(de)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶，如牙齦、觸(chu)膜等(deng)上皮(pi)組織和關節(jie)滑(hua)膜、椎間盤內(nei)都(dou)不(bu)同程度的(de)(de)(de)存在著這種(zhong)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶，它(ta)在體(ti)內(nei)膠原(yuan)(yuan)(yuan)蛋白的(de)(de)(de)分(fen)解(jie)過程中發揮著不(bu)可或(huo)缺的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。藥(yao)用(yong)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶是(shi)指利用(yong)生物(wu)制(zhi)藥(yao)的(de)(de)(de)高(gao)科技手段從溶(rong)組織梭狀芽孢桿(gan)菌的(de)(de)(de)發酵(jiao)液中提取、純化(hua)并精(jing)制(zhi)而得的(de)(de)(de)白色(se)(se)或(huo)類白色(se)(se)無菌凍干粉針生物(wu)制(zhi)劑。

膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)（collagenase）是從溶(rong)組(zu)織(zhi)(zhi)梭(suo)狀細(xi)(xi)胞(bao)(bao)芽孢桿菌提取制備的，主要(yao)(yao)水(shui)解(jie)結締(di)組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)蛋(dan)白成分(fen)。當擬(ni)消(xiao)化的組(zu)織(zhi)(zhi)較硬，內含較多結締(di)組(zu)織(zhi)(zhi)或膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)成分(fen)時(shi)，用胰蛋(dan)白酶(mei)解(jie)離(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的效果(guo)較差，這時(shi)可采(cai)用膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)解(jie)離(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)法。 膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)僅對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)間質有(you)消(xiao)化作用而(er)對上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)影響(xiang)不大。因此適(shi)于消(xiao)化分(fen)離(li)纖(xian)維(wei)性組(zu)織(zhi)(zhi)、上(shang)皮(pi)及癌組(zu)織(zhi)(zhi)，可使上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)與膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)成分(fen)分(fen)離(li)而(er)不受(shou)損害(hai)。常用劑量(liang)為最終濃度(du)200U/ml（約(yue)為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)分(fen)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以(yi)及肝細(xi)(xi)胞(bao)(bao)專用膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)，要(yao)(yao)根據所要(yao)(yao)分(fen)離(li)消(xiao)化的組(zu)織(zhi)(zhi)類(lei)型選擇膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)酶(mei)類(lei)型。

1、膠原酶Ⅰ用于上(shang)(shang)皮、肺，脂(zhi)肪和腎上(shang)(shang)腺組織細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)。用于消化組織中(zhong)連接部分使(shi)其成為單個細(xi)胞(bao)，用于哺乳動細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)。

2、膠原酶Ⅳ包含(han)至少7種(zhong)蛋(dan)白酶成分，分子量(liang)從68-130KD不等。它(ta)能消化多種(zhong)組(zu)織(zhi)。

3、膠原酶Ⅴ包含(han)至(zhi)少(shao)7種蛋(dan)白酶成(cheng)分(fen)(fen)(fen)(fen)，分(fen)(fen)(fen)(fen)子量從(cong)68-130KD不(bu)等。它(ta)可用于胰腺小島組織(zhi)(zhi)的分(fen)(fen)(fen)(fen)離，將(jiang)結(jie)締組織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)(fen)離成(cheng)單個(ge)細胞。

4、膠(jiao)原酶Ⅱ適(shi)用于肝臟(zang)，骨，甲狀(zhuang)腺，心臟(zang)和唾液腺組織。

二、如何配置膠原酶

膠原酶(mei)溶液同胰(yi)蛋白酶(mei)一樣配制、消毒滅菌和儲藏。

注意：因(yin)為(wei)Ⅰ型膠原酶分(fen)子顆(ke)粒比胰酶大(da)，不容易過濾(lv)，因(yin)此可以(yi)用蔡式(shi)濾(lv)器過濾(lv)除菌。 　　鈣、鎂離子和血清成分(fen)不會影響膠原酶的(de)消(xiao)化作用，因(yin)而可用BSS（如D-hanks或(huo)(huo)者PBS）或(huo)(huo)含血清的(de)培養液配制。

三、膠原酶的使用

1、將漂洗、修剪干(gan)凈(jing)的組織剪成1~2mm左右小(xiao)塊。

2、將組織塊放入(ru)(ru)離心管（三角燒(shao)瓶）中(zhong)加入(ru)(ru)30~50倍體積(ji)的膠原酶(mei)溶液，旋(xuan)緊蓋(gai)子（密封燒(shao)瓶）。

3、將燒瓶放(fang)(fang)入37℃水浴或(huo)(huo)者37℃孵(fu)箱(xiang)內，每(mei)隔3min振搖(yao)一(yi)次，如能放(fang)(fang)在37℃的恒溫震(zhen)蕩水浴箱(xiang)中則更好。消(xiao)(xiao)化時(shi)間(jian)與組(zu)(zu)(zu)織(zhi)的類別很有關系，對(dui)于(yu)某些腫瘤組(zu)(zu)(zu)織(zhi)或(huo)(huo)其他較致(zhi)密結締組(zu)(zu)(zu)織(zhi)，消(xiao)(xiao)化時(shi)間(jian)4~48h，對(dui)于(yu)容易消(xiao)(xiao)化的組(zu)(zu)(zu)織(zhi)可以采用37℃震(zhen)蕩消(xiao)(xiao)化15~45min，也(ye)可以根據具(ju)體(ti)情況而定。如組(zu)(zu)(zu)織(zhi)塊已分(fen)散(san)而失(shi)去塊的形狀，一(yi)經搖(yao)動即成(cheng)(cheng)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)團或(huo)(huo)單個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，可以認(ren)為已消(xiao)(xiao)化充分(fen)。上皮(pi)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)經膠原(yuan)酶消(xiao)(xiao)化后，由于(yu)上皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)對(dui)此(ci)酶有耐受性，可能仍有一(yi)些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)團未完全分(fen)散(san)，但成(cheng)(cheng)團的上皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)比分(fen)散(san)的單個(ge)上皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)更易生長(chang)，因此(ci)，如無(wu)特殊需要可以不(bu)必再進一(yi)步處理(li)。

4、收集消(xiao)化液(ye)（有時含個別(bie)組織塊及沒有充分(fen)消(xiao)化的組織碎屑則需(xu)用100目不(bu)銹(xiu)鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除(chu)(chu)上清(qing)，用Hanks液(ye)或(huo)者無血清(qing)培養液(ye)離心漂洗1~2次(ci)，去除(chu)(chu)上清(qing)，加培養液(ye)制成細胞懸液(ye)，接種培養瓶。