黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬(1qav/virus)包(bao)含80多個成員，屬于(yu)正鏈RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，其中半(ban)數以上的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)能(neng)夠誘發(fa)人(ren)(ren)和動物(wu)產生疾病(bing)(bing)(bing)，患(huan)病(bing)(bing)(bing)率(lv)高而治愈率(lv)低，容(rong)易留下一(yi)些嚴重的(de)(de)后遺癥，給(gei)人(ren)(ren)類健康帶來很大威脅，如流行性(xing)乙型腦(nao)炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(JEV)、登革熱病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(DEN)、黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(YFV)、蜱傳(chuan)腦(nao)炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(TBEV)等。一(yi)直以來人(ren)(ren)們對(dui)RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)了解都比較缺乏，無論(lun)是(shi)分(fen)子(zi)水平上的(de)(de)機理研究，還是(shi)宏(hong)觀上疫苗的(de)(de)研制、藥物(wu)的(de)(de)開發(fa)，其進(jin)展都非常緩慢。
嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)是(shi)一(yi)種基因工程重(zhong)(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，在(zai)制(zhi)備(bei)技術上(shang)并不(bu)存在(zai)太大問(wen)題，但作為(wei)重(zhong)(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，在(zai)安全性上(shang)還有一(yi)定(ding)的(de)風險，在(zai)自然條件(jian)下，有病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)之間自發產生(sheng)重(zhong)(zhong)組的(de)例子(zi)，可(ke)能獲得一(yi)些意想不(bu)到的(de)新型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，比(bi)母體株毒(du)(du)(du)(du)力更強(qiang)，對生(sheng)物體更具(ju)有威脅性。所以在(zai)制(zhi)備(bei)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)時(shi)，要采用(yong)已知特性的(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株作為(wei)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)骨架結構，特別是(shi)多選用(yong)減毒(du)(du)(du)(du)株作為(wei)載體病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)目前黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)采用(yong)的(de)載體主要有以下幾種。
YF一(yi)17DD 疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu) YF一(yi)17DD是(shi)(shi)目前預(yu)防黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感染的(de)一(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)活疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)】，始用(yong)于1936年，在過(guo)去的(de)6O多(duo)年中(zhong)，有(you)超過(guo)3億人接(jie)(jie)種(zhong)過(guo)該(gai)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)，安全有(you)效。該(gai)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)免疫(yi)原性(xing)(xing)很好，單劑量接(jie)(jie)種(zhong)后10d內，近lo0%的(de)接(jie)(jie)種(zhong)者(zhe)產生中(zhong)和抗體，免疫(yi)力持久甚至能夠維持終身。將YF一(yi)17DD疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)和原病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)YF—Asibi進(jin)行序列(lie)比較后發現，該(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)抗原表位(wei)多(duo)集中(zhong)在E基因(yin)，構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)多(duo)以(yi)這(zhe)一(yi)段基因(yin)作為(wei)靶基因(yin)。這(zhe)樣(yang)構(gou)建(jian)的(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)中(zhong)，由YF一(yi)17DD株(zhu)(zhu)保留的(de)NS蛋白(bai)基因(yin)只(zhi)是(shi)(shi)誘發針對該(gai)蛋白(bai)的(de)CTLs和非中(zhong)和性(xing)(xing)抗體，而(er)不具(ju)有(you)交叉(cha)保護(hu)性(xing)(xing)，所以(yi)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作為(wei)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)使(shi)用(yong)時(shi)不會引(yin)起一(yi)般重組(zu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)帶來的(de)抗載(zai)體免疫(yi)反(fan)應，即使(shi)曾(ceng)經接(jie)(jie)種(zhong)過(guo)YF一(yi)17DD的(de)接(jie)(jie)痘者(zhe)再接(jie)(jie)種(zhong)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)也是(shi)(shi)安全有(you)效的(de)，可以(yi)作為(wei)一(yi)個(ge)理想的(de)活疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體。1989年Rice等(deng)151構(gou)建(jian)了(le)YF一(yi)17DD的(de)感染性(xing)(xing)克隆，為(wei)構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)提供(gong)了(le)方便，目前文獻中(zhong)報道的(de)有(you)關黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)合(he)株(zhu)(zhu)多(duo)以(yi)此病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作為(wei)載(zai)體病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。已(yi)經成(cheng)功構(gou)建(jian)了(le)包括JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個(ge)血清型病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)嵌(qian)(qian)合(he)體。
YF一17DD 疫苗株
DEN一4變異株(zhu)(zhu) 登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)分為4個(ge)(ge)血(xue)清型，這4型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)結構(gou)(gou)蛋白氨基酸序列同源(yuan)性(xing)(xing)高達62%-74%，并且它們(men)之間還有很(hen)好的(de)(de)(de)交叉(cha)免疫原性(xing)(xing)，一直以(yi)來，人們(men)試圖(tu)構(gou)(gou)建登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)4價疫苗，Bray等從(cong)1991年開(kai)始登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)研究，以(yi)DEN一4814669株(zhu)(zhu)全(quan)長克隆作為載(zai)(zai)體(ti)，構(gou)(gou)建了包括DEN—l到(dao)DEN一3的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，結果發現幾(ji)株(zhu)(zhu)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)(xing)并沒(mei)有太大(da)改變，他(ta)們(men)認(ren)為若能夠以(yi)一個(ge)(ge)毒(du)(du)性(xing)(xing)低的(de)(de)(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)作為載(zai)(zai)體(ti)骨架(jia)，可能會使(shi)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)(xing)下降，由于(yu)3端(duan)(duan)(duan)(duan)和(he)(he)5端(duan)(duan)(duan)(duan)非(fei)編碼區(qu)在(zai)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)復制(zhi)中可能也起到(dao)調(diao)控(kong)作用(yong)(yong)，他(ta)們(men)在(zai)構(gou)(gou)建的(de)(de)(de)DEN一4感染性(xing)(xing)克隆的(de)(de)(de)基礎上，刪除其(qi)(qi)3端(duan)(duan)(duan)(duan)和(he)(he)5端(duan)(duan)(duan)(duan)非(fei)編碼區(qu)的(de)(de)(de)部分序列，結果篩(shai)選到(dao)一株(zhu)(zhu)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)，其(qi)(qi)3端(duan)(duan)(duan)(duan)去掉了3O個(ge)(ge)核苷酸，毒(du)(du)性(xing)(xing)降低但(dan)是(shi)免疫原性(xing)(xing)并沒(mei)有改變。用(yong)(yong)這個(ge)(ge)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)作為載(zai)(zai)體(ti)和(he)(he)其(qi)(qi)它3個(ge)(ge)血(xue)清型的(de)(de)(de)登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)構(gou)(gou)成(cheng)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)后，果然有效地(di)降低了病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)(xing)；其(qi)(qi)后這個(ge)(ge)載(zai)(zai)體(ti)也用(yong)(yong)于(yu)構(gou)(gou)建黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬其(qi)(qi)他(ta)成(cheng)員的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)。
DEN一4變(bian)異(yi)株
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu) 該(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)也(ye)主(zhu)要(yao)(yao)是用于(yu)合成(cheng)登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)嵌合疫(yi)苗，2O世(shi)紀(ji)8O年代初期(qi)，泰國Mahidol實驗室將4種血清型的(de)(de)(de)登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)經過(guo)在細胞傳代中(zhong)后(hou)獲得各自的(de)(de)(de)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，其中(zhong)以DEN一(yi)2PDK一(yi)53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)效果最(zui)好，免疫(yi)保(bao)護(hu)力(li)最(zui)強最(zui)持久(jiu)。將該(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和野生(sheng)株(zhu)(zhu)進行比較(jiao)，發現核苷酸水平上的(de)(de)(de)變異主(zhu)要(yao)(yao)在非結構(gou)區，說(shuo)明該(gai)病毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力(li)有(you)關的(de)(de)(de)基因(yin)可能在非結構(gou)區，而黃(huang)熱(re)病毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)屬其他成(cheng)員的(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力(li)基因(yin)多位于(yu)E蛋白，這(zhe)樣(yang)構(gou)建的(de)(de)(de)嵌合病毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)機制主(zhu)要(yao)(yao)由(you)供(gong)體(ti)(ti)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性起(qi)主(zhu)要(yao)(yao)因(yin)素，而由(you)DEN一(yi)2PDK-53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)構(gou)建的(de)(de)(de)嵌合疫(yi)苗毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性的(de)(de)(de)減(jian)弱由(you)供(gong)體(ti)(ti)和受體(ti)(ti)共同決(jue)定，更有(you)利于(yu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)獲得
DEN一2 PDK一53減(jian)毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)2減(jian)毒(du)(du)株作為嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)載體還有另(ling)外一(yi)(yi)(yi)個好處，登革(ge)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)4個血(xue)清型(xing)之間產生交(jiao)叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力，所(suo)以(yi)異(yi)型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)二(er)次感染(ran)由于(yu)抗體依賴的(de)(de)(de)(de)(de)增強作用(yong)可(ke)以(yi)導(dao)致登革(ge)出血(xue)熱(re)/登革(ge)熱(re)休(xiu)克綜合(he)征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)生，理想的(de)(de)(de)(de)(de)登革(ge)4價疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力要針(zhen)對(dui)4種血(xue)清型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，有效而且要持久，其中任何一(yi)(yi)(yi)種血(xue)清型(xing)抗體的(de)(de)(de)(de)(de)消(xiao)減(jian)都有發(fa)生DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能。流行病(bing)(bing)(bing)學(xue)資料表明(ming)，DEN幾(ji)個血(xue)清型(xing)感染(ran)人(ren)的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)(lv)是不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)，其中以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)感染(ran)概(gai)率(lv)(lv)最(zui)高，所(suo)以(yi)由其它(ta)幾(ji)種血(xue)清型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)誘發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反(fan)應(ying)很易(yi)識別DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，由此(ci)DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)誘發(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)(lv)明(ming)顯大于(yu)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4；另(ling)外DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)特異(yi)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力又(you)明(ming)顯弱于(yu)其它(ta)3型(xing)，所(suo)以(yi)制備以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2為基礎的(de)(de)(de)(de)(de)4價疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗和傳統疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗比較，減(jian)少了(le)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)4種血(xue)清型(xing)NS3蛋白(bai)誘發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)交(jiao)叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反(fan)應(ying)之間的(de)(de)(de)(de)(de)干擾作用(yong)，減(jian)少了(le)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能，同(tong)時又(you)能有效而持久地誘導(dao)機(ji)體產生針(zhen)對(dui)4種血(xue)清型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反(fan)應(ying)，從而起到(dao)預防作用(yong)。
克隆(long)法 嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)的(de)獲得大(da)多是利用感染性(xing)克隆(long)技術，目前已有部(bu)(bu)分黃熱病(bing)毒(du)(du)屬病(bing)毒(du)(du)獲得了(le)感染性(xing)克隆(long)，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)毒(du)(du)、墨(mo)累河谷(gu)腦炎病(bing)毒(du)(du)(MVE)、西尼羅河病(bing)毒(du)(du)(WNV)、DEN4型病(bing)毒(du)(du)，這(zhe)些克隆(long)包含有病(bing)毒(du)(du)的(de)全部(bu)(bu)基(ji)因，能(neng)夠在宿主(zhu)菌中穩(wen)(wen)定地復制和(he)傳代，以作(zuo)為(wei)種子批保存。當構建嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)時，在供體(ti)(ti)(ti)(ti)基(ji)因和(he)受體(ti)(ti)(ti)(ti)基(ji)因的(de)連(lian)接處，通過同(tong)義(yi)突變(bian)或者保守突變(bian)，為(wei)受體(ti)(ti)(ti)(ti)株和(he)供體(ti)(ti)(ti)(ti)株基(ji)因組添加合(he)(he)適的(de)酶切位點，然后(hou)將(jiang)兩(liang)者利用酶切位點連(lian)接起來，制備嵌(qian)(qian)合(he)(he)性(xing)克隆(long)，體(ti)(ti)(ti)(ti)外經RNA聚合(he)(he)酶作(zuo)用轉錄(lu)出嵌(qian)(qian)合(he)(he)性(xing)轉錄(lu)子，轉染細(xi)胞后(hou)重新獲得嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)。這(zhe)項技術的(de)一個優點在于在它是在cDNA水平上的(de)操作(zuo)，突變(bian)率低、表型穩(wen)(wen)定，不像傳統疫苗研制過程中容易發(fa)生(sheng)(sheng)一系列的(de)生(sheng)(sheng)物特(te)性(xing)改變(bian)。
克隆法
融合(he)(he)PCR 利(li)(li)用PCR技術(shu)制備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒最大(da)的(de)(de)優點(dian)在(zai)于(yu)方便(bian)快捷，過去(qu)幾個(ge)月的(de)(de)工作現(xian)在(zai)幾天就能完成。目前生物技術(shu)產品日臻完善，不少公司(si)推出高保真(zhen)、熱穩定(ding)性好(hao)的(de)(de)逆轉錄酶(mei)和DNA聚合(he)(he)酶(mei)，如(ru)SuperscriptII逆轉錄酶(mei)、LAro~酶(mei)、Exraq酶(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚合(he)(he)酶(mei)系(xi)統等，利(li)(li)用這些酶(mei)可以有效地擴增(zeng)出病(bing)毒基因(yin)組大(da)片段(>5kh)甚至全長的(de)(de)cDNA。用4條引(yin)物、3次PCR可以把兩(liang)個(ge)異質基因(yin)片段連接在(zai)一起(qi)。另(ling)有報道利(li)(li)用3個(ge)引(yin)物、兩(liang)次PCR即可制備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)(he)基因(yin)，如(ru)YF—MOD嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒。
融合PCR
與克(ke)隆(long)技術相(xiang)比(bi)較，PCR方(fang)法(fa)更為(wei)靈(ling)活，可以(yi)選(xuan)擇任意位置(zhi)進行嵌合；但(dan)是PCR具有(you)(you)一定(ding)的突(tu)(tu)變(bian)率，可能會帶來一些致死性突(tu)(tu)變(bian)而使轉(zhuan)錄體(ti)不(bu)具有(you)(you)感染性，得(de)不(bu)到恢復病毒從(cong)而前功盡棄，所以(yi)現在大多(duo)數實驗還是采(cai)取(qu)克(ke)隆(long)法(fa)。
滅(mie)活(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)之(zhi)間(jian)的基因重(zhong)(zhong)組 是將兩(liang)種(zhong)或者兩(liang)種(zhong)以上的滅(mie)活(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，在同(tong)(tong)一(yi)細胞內培養(yang)后，它們之(zhi)間(jian)發生(sheng)基因重(zhong)(zhong)組，有(you)時會產生(sheng)感染性病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，這種(zhong)方法又稱為多重(zhong)(zhong)復合(he)(he)，可能由于滅(mie)活(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)受損的基因經重(zhong)(zhong)組后得以替(ti)補。如為了(le)解包(bao)膜病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的融合(he)(he)活(huo)(huo)(huo)性，利用(yong)黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)YF一(yi)17DD和(he)流感病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)X31兩(liang)者不同(tong)(tong)的融合(he)(he)條件，以及(ji)核衣殼不同(tong)(tong)的形(xing)態，將YF一(yi)17DD通過(guo)酸處(chu)理失去融合(he)(he)活(huo)(huo)(huo)性，X31通過(guo)熱(re)處(chu)理滅(mie)活(huo)(huo)(huo)，兩(liang)者在YF一(yi)17DD滅(mie)活(huo)(huo)(huo)的同(tong)(tong)一(yi)pH值下發生(sheng)融和(he)反應，只(zhi)有(you)發生(sheng)融和(he)反應的嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)具有(you)感染性；流感病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)提供(gong)功(gong)能型膜蛋白融合(he)(he)成(cheng)分，YF一(yi)17DD提供(gong)功(gong)能基因組，結果兩(liang)個滅(mie)活(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)又重(zhong)(zhong)新構建成(cheng)新的病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。這項(xiang)技術隨機性很大(da)，但是可能得到意想不到的結果，可以用(yong)于病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)功(gong)能的研(yan)究。
黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)構(gou)(gou)(gou)建(jian)前(qian)提在于(yu)，所有(you)的(de)(de)(de)(de)黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)(de)結構(gou)(gou)(gou)是高度保守的(de)(de)(de)(de)，它們均為單股正鏈RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，基(ji)因(yin)組(zu)全長(chang)約l1kb，5端(duan)有(you)帽子(zi)結構(gou)(gou)(gou)，3端(duan)無(wu)poly(A)尾，一(yi)個長(chang)的(de)(de)(de)(de)開放閱讀(du)框(kuang)架覆蓋了大部分(fen)基(ji)因(yin)組(zu)，共(gong)編碼3個結構(gou)(gou)(gou)蛋白和(he)7個非結構(gou)(gou)(gou)蛋白，其中以E蛋白和(he)免疫原(yuan)性關系(xi)最為密(mi)切，所以構(gou)(gou)(gou)建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)一(yi)般(ban)都要取供體病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)E基(ji)因(yin)；但并(bing)不(bu)是所有(you)構(gou)(gou)(gou)建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌合性cDNA克隆都具有(you)感染性，其主要影響因(yin)素如下。
技術(shu)方面(mian) 雖然(ran)現在(zai)(zai)工具酶的(de)(de)保真性和效(xiao)率越來越好，但是黃熱病(bing)毒(du)長(chang)10kb以上，在(zai)(zai)基因(yin)操作中不可(ke)避免有(you)突(tu)變(bian)(bian)的(de)(de)發生，而有(you)些突(tu)變(bian)(bian)是致死性突(tu)變(bian)(bian)，使得(de)構建的(de)(de)全長(chang)cDNA克隆(long)或(huo)者嵌合體克隆(long)沒有(you)感染(ran)性。另(ling)外這(zhe)些突(tu)變(bian)(bian)還影響(xiang)恢復病(bing)毒(du)的(de)(de)生物學特性，如溫度敏感性、噬斑(ban)大小、復制能(neng)(neng)力、嗜(shi)細胞(bao)能(neng)(neng)力都可(ke)能(neng)(neng)發生改變(bian)(bian)。
技術方面
嵌(qian)合(he)位點(dian) 結(jie)構(gou)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)基(ji)因之間的(de)(de)連(lian)接(jie)處有(you)一(yi)段(duan)親脂區(qu)(qu)(qu)序(xu)列，是構(gou)建嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)時將兩段(duan)異(yi)質核(he)苷(gan)酸(suan)序(xu)列進行連(lian)接(jie)的(de)(de)嵌(qian)合(he)位點(dian)處，這一(yi)段(duan)序(xu)列的(de)(de)保守性(xing)(xing)對于嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)復(fu)制能(neng)力至(zhi)關重要。如(ru)在(zai)prM和C基(ji)因之間有(you)信號(hao)肽酶切(qie)割(ge)位點(dian)以及蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶切(qie)割(ge)位點(dian)，Cau—four等在(zai)構(gou)建YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)時選擇(ze)這兩處作為(wei)嵌(qian)合(he)位點(dian)，結(jie)果在(zai)信號(hao)肽酶切(qie)割(ge)位點(dian)處嵌(qian)合(he)的(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)有(you)感染(ran)性(xing)(xing)，而在(zai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶切(qie)割(ge)位點(dian)處進行連(lian)接(jie)無法獲得病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，因為(wei)在(zai)兩個位點(dian)之間有(you)一(yi)段(duan)親脂性(xing)(xing)的(de)(de)轉膜區(qu)(qu)(qu)，YFv這一(yi)區(qu)(qu)(qu)域比(bi)DEN一(yi)2該區(qu)(qu)(qu)域要多(duo)6個氨(an)(an)基(ji)酸(suan)；在(zai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶切(qie)割(ge)位點(dian)處構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合(he)體，由(you)于這一(yi)轉膜區(qu)(qu)(qu)缺少了6個氨(an)(an)基(ji)酸(suan)，蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶和信號(hao)肽酶不能(neng)正確(que)識別切(qie)割(ge)位點(dian)，從而影響prM蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)和E蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)成熟，病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)復(fu)制過程受到(dao)阻礙，病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆(ke)粒沒法進行正常的(de)(de)包裝，所以無法分泌出(chu)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆(ke)粒。
嵌合位點
供(gong)(gong)體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin) 目前構建的嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)多(duo)為(wei)供(gong)(gong)體(ti)株(zhu)提供(gong)(gong)P和E基(ji)因(yin)，人們也(ye)嘗試過替代C基(ji)因(yin)或者部分基(ji)因(yin)，但多(duo)數沒(mei)有(you)(you)成(cheng)功(gong)，其可能(neng)(neng)的原因(yin)是位(wei)于C蛋白區(qu)域的保(bao)守(shou)序(xu)列與受(shou)體(ti)株(zhu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)順式結構不相容性(xing)，進而(er)對嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)RNA的復制(zhi)產生了毒(du)(du)性(xing)，如Kuniin病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)RNA復制(zhi)必須有(you)(you)同源(yuan)C蛋白上的第2位(wei)和第20位(wei)氨基(ji)酸的存，而(er)異(yi)(yi)質(zhi)基(ji)因(yin)的C蛋白不能(neng)(neng)協(xie)助(zhu)Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)復制(zhi)，所以無法長成(cheng)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)顆粒(li)；另外也(ye)可能(neng)(neng)是異(yi)(yi)質(zhi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)之間的蛋白酶識別對方序(xu)列的能(neng)(neng)力(li)(li)低下，對于C—prM部位(wei)的切割(ge)效率低，影響病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)正常的裝配和釋(shi)放能(neng)(neng)力(li)(li)。
供體病毒
受體(ti)病(bing)(bing)毒(du)基因 作為(wei)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)載體(ti)，嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)中的(de)大部分基因由(you)受體(ti)株提供，嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)的(de)復(fu)制特(te)性(xing)(xing)也主要(yao)由(you)受體(ti)株的(de)基因控制，其(qi)中有(you)些序(xu)列對(dui)于(yu)嵌(qian)合(he)(he)體(ti)的(de)感(gan)染(ran)(ran)性(xing)(xing)有(you)決定性(xing)(xing)作用，在構(gou)(gou)建(jian)嵌(qian)合(he)(he)體(ti)時，如(ru)果這(zhe)部分序(xu)列受到破壞，就不能(neng)夠獲得恢復(fu)病(bing)(bing)毒(du)。如(ru)在構(gou)(gou)建(jian)DEN一(yi)4和WNV的(de)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)時四，由(you)WNVNY99的(de)prM和E基因代替DEN一(yi)4相(xiang)應位(wei)置(zhi)的(de)基因，在構(gou)(gou)建(jian)的(de)18個克(ke)隆(long)(long)中僅有(you)兩(liang)(liang)個具(ju)有(you)感(gan)染(ran)(ran)性(xing)(xing)，序(xu)列比(bi)較(jiao)發現這(zhe)兩(liang)(liang)個克(ke)隆(long)(long)在prM和C蛋(dan)(dan)白(bai)之(zhi)間的(de)NS2A—NS2B蛋(dan)(dan)白(bai)酶切割位(wei)點下(xia)游(you)，在轉(zhuan)膜信號區域中都包含一(yi)基序(xu)，這(zhe)一(yi)基序(xu)是酶切割位(wei)點下(xia)游(you)的(de)第(di)(di)3位(wei)及第(di)(di)6位(wei)分別為(wei)天冬氨酸和蘇(su)氨酸，另外16個克(ke)隆(long)(long)則沒有(you)該(gai)位(wei)點，實驗表明這(zhe)兩(liang)(liang)個位(wei)點似乎和嵌(qian)合(he)(he)性(xing)(xing)克(ke)隆(long)(long)的(de)感(gan)染(ran)(ran)性(xing)(xing)有(you)關(guan)。
受體病毒
嵌(qian)合(he)病毒的(de)一(yi)個最大(da)特點(dian)是表型多(duo)發(fa)生變(bian)(bian)(bian)化，如復制能(neng)(neng)力、毒力、抗原性等，可能(neng)(neng)的(de)原因(yin)是由于缺乏校正(zheng)功能(neng)(neng)的(de)聚合(he)酶存在，而有(you)異質基(ji)因(yin)的(de)正(zheng)鏈RNA病毒，在病毒復制中具有(you)較高的(de)基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)(bian)(bian)率，并且這(zhe)些突(tu)變(bian)(bian)(bian)為了適應不同的(de)宿(su)主細胞，可能(neng)(neng)會發(fa)生一(yi)些特性改變(bian)(bian)(bian)，從而出(chu)現一(yi)些預想不到的(de)結果。
生長特(te)性(xing)改變 嵌合病毒的(de)兩(liang)個母體病毒的(de)易感細胞(bao)不同，得到的(de)嵌合病毒在不同細胞(bao)中復制時(shi)，由(you)于缺乏有效的(de)復制酶而(er)引起生長特(te)性(xing)的(de)改變，其嗜細胞(bao)性(xing)也(ye)會有所改變，另外噬斑試驗中噬斑形態(tai)
生長特性改變
大小都多(duo)有變化。如(ru)Chimeri—JE嵌(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)(ti)在(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細(xi)胞(bao)(bao)中復制(zhi)形(xing)式類似，而(er)在(zai)MRC一(yi)5、FRhl細(xi)胞(bao)(bao)中雖(sui)然病(bing)(bing)毒滴度能(neng)(neng)(neng)夠(gou)(gou)達到6log。0pfu/mL，但是(shi)卻不(bu)(bu)能(neng)(neng)(neng)產生CPE，這(zhe)些特性和(he)母體(ti)(ti)(ti)株(zhu)YFV以及JEV都截(jie)然不(bu)(bu)同。LGT1和(he)E5是(shi)TBEV的兩個弱毒株(zhu)，與DEN一(yi)4病(bing)(bing)毒組成的嵌(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)(ti)在(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)中復制(zhi)能(neng)(neng)(neng)力(li)(li)下降，而(er)轉(zhuan)染蚊(wen)(wen)蟲細(xi)胞(bao)(bao)復制(zhi)能(neng)(neng)(neng)力(li)(li)不(bu)(bu)受影響，用(yong)在(zai)蚊(wen)(wen)蟲細(xi)胞(bao)(bao)傳代的嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒在(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)LLC—MK2中不(bu)(bu)能(neng)(neng)(neng)夠(gou)(gou)形(xing)成噬斑，而(er)在(zai)早期(qi)構建的DEN一(yi)4和(he)另一(yi)個TBEV病(bing)(bing)毒株(zhu)構建的嵌(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)(ti)在(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)中卻能(neng)(neng)(neng)夠(gou)(gou)得到比DEN一(yi)4病(bing)(bing)毒滴度高1000倍(bei)的嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒。
神(shen)(shen)經(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)和神(shen)(shen)經(jing)外(wai)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing) 神(shen)(shen)經(jing)內(nei)(外(wai))毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)低(di)而免疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)好(hao)是(shi)一(yi)(yi)(yi)個理想疫(yi)(yi)苗應具備的(de)品質，許多實(shi)驗室經(jing)過多年研(yan)(yan)究雖然篩檢出(chu)一(yi)(yi)(yi)些減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，但是(shi)兩(liang)(liang)者多不能達到(dao)有(you)(you)效的(de)統(tong)一(yi)(yi)(yi)。嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)技術以“取長補短”的(de)原(yuan)(yuan)則，將兩(liang)(liang)種病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)免疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)和毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)結合(he)起來，以期研(yan)(yan)制理想疫(yi)(yi)苗，就目(mu)前得(de)到(dao)的(de)一(yi)(yi)(yi)些嵌(qian)(qian)(qian)合(he)株(zhu)(zhu)來說，確實(shi)取得(de)了一(yi)(yi)(yi)些令人滿意的(de)結果，如(ru)DEN一(yi)(yi)(yi)4和WNV的(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)與WNV相比高度(du)減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)四，腦內(nei)接種戒奶小鼠，神(shen)(shen)經(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)降(jiang)低(di)至1/28500；腹(fu)腔內(nei)接種小鼠，神(shen)(shen)經(jing)外(wai)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)下降(jiang)至1/10000，免疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)好(hao)，能安全(quan)保(bao)護小鼠接受野(ye)生(sheng)株(zhu)(zhu)攻擊(ji)。另外(wai)如(ru)ChimeriVax—JE嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)也較母體株(zhu)(zhu)YFV和JEV呈大幅度(du)下降(jiang)，而單劑量又具備很好(hao)的(de)免疫(yi)(yi)保(bao)護力；還有(you)(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)都有(you)(you)所下降(jiang)，這些嵌(qian)(qian)(qian)合(he)體都在進一(yi)(yi)(yi)步的(de)研(yan)(yan)究中。
神經內毒性(xing)和神經外毒性(xing)
基(ji)因穩定性 因為RNA病(bing)(bing)毒(du)(du)易以(yi)(yi)準(zhun)種的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)式出現和易變(bian)異的(de)(de)(de)(de)(de)特性，作為活疫苗(miao)來使用(yong)，一(yi)(yi)個重要的(de)(de)(de)(de)(de)條件是(shi)基(ji)因型要穩定，這(zhe)一(yi)(yi)點(dian)是(shi)疫苗(miao)安全性的(de)(de)(de)(de)(de)重要表(biao)現。嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)穩定性主要通(tong)過(guo)(guo)返祖實驗檢(jian)定，即(ji)在(zai)乳鼠(shu)腦(nao)內和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)進行(xing)培(pei)養，觀察有無明(ming)顯表(biao)型變(bian)化，必要時進行(xing)核苷酸(suan)鑒定，如ChimeriVax-JE嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)115．161在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內傳(chuan)(chuan)(chuan)代l8次以(yi)(yi)及在(zai)乳鼠(shu)腦(nao)內傳(chuan)(chuan)(chuan)代6次并沒(mei)有毒(du)(du)力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)回升，對(dui)減(jian)毒(du)(du)位點(dian)進行(xing)測(ce)序也沒(mei)有發生核苷酸(suan)改變(bian)。而(er)有的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)穩定性不夠好如DEN一(yi)(yi)2/DEN一(yi)(yi)4、DEN一(yi)(yi)2/DEN—l復(fu)制(zhi)能力(li)較弱，而(er)經(jing)過(guo)(guo)幾次傳(chuan)(chuan)(chuan)代后得到較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)滴度，是(shi)因為發生了一(yi)(yi)些突變(bian)。在(zai)體外轉(zhuan)錄時產生了轉(zhuan)錄體的(de)(de)(de)(de)(de)雜和體，在(zai)轉(zhuan)染后經(jing)過(guo)(guo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)復(fu)制(zhi)，復(fu)制(zhi)能力(li)增強的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)逐漸占(zhan)主要優勢，在(zai)LLC—MK2細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)病(bing)(bing)毒(du)(du)傳(chuan)(chuan)(chuan)代可(ke)以(yi)(yi)保持較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)(chuan)穩定性，所以(yi)(yi)在(zai)制(zhi)備(bei)嵌合疫苗(miao)時，應盡量(liang)減(jian)少病(bing)(bing)毒(du)(du)在(zai)哺乳動物細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)傳(chuan)(chuan)(chuan)代的(de)(de)(de)(de)(de)次數(shu)。
基因穩定性
在(zai)黃熱(re)病(bing)毒(du)嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)發展的(de)這十幾年中，人們嘗試構建了多種嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)，其中大部分是(shi)以制備疫苗(miao)為(wei)目的(de)，另外還用于(yu)病(bing)毒(du)的(de)分子(zi)生物學特性研(yan)究(jiu)。
分子生物學特性研究 型內嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)可以用(yong)于(yu)了解病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)復(fu)制能(neng)力(li)，進(jin)一(yi)步(bu)了解各(ge)基因的(de)功能(neng)。如構(gou)建同型不(bu)同株(zhu)(zhu)之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)DEN一(yi)216681/PDK一(yi)53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)型內嵌合(he)疫(yi)苗(miao)，研究DEN一(yi)2型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結(jie)構(gou)蛋白(bai)區對乳鼠神經毒(du)(du)(du)性的(de)影響。可以用(yong)于(yu)推(tui)測病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)力(li)位點，由2個(ge)(ge)(ge)JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA克隆(long)提供(gong)5端，3個(ge)(ge)(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA提供(gong)的(de)3端進(jin)行組合(he)，感染細(xi)胞后重新獲得6種重組JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。根據噬(shi)菌(jun)斑大小篩(shai)選到3個(ge)(ge)(ge)減毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，比(bi)較(jiao)(jiao)6種重組病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)野生株(zhu)(zhu)的(de)基因序列，發現(xian)僅(jin)僅(jin)是(shi)E138(Glu—Lys)一(yi)個(ge)(ge)(ge)氨基酸(suan)位點不(bu)同，說明這個(ge)(ge)(ge)位點和(he)毒(du)(du)(du)力(li)之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)關系(xi)密切；另外發現(xian)該突(tu)變株(zhu)(zhu)雖然毒(du)(du)(du)性降低(di)(di)，但(dan)是(shi)腦(nao)內注射接種小鼠后仍能(neng)在腦(nao)內復(fu)制，但(dan)是(shi)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度(du)(du)比(bi)較(jiao)(jiao)低(di)(di)，看來其減毒(du)(du)(du)機制不(bu)在于(yu)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復(fu)制，而(er)可能(neng)是(shi)影響復(fu)制的(de)早期機制，在細(xi)胞之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)傳遞速度(du)(du)比(bi)較(jiao)(jiao)慢，從而(er)使免疫(yi)系(xi)統能(neng)及(ji)時清除病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
分子生物學特性研究
型間嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)也可以用(yong)于(yu)分(fen)子生(sheng)物(wu)(wu)學特(te)(te)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)研(yan)究，如(ru)(ru)黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)和日本腦炎病(bing)毒(du)(du)(du)雖然(ran)同屬黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)屬，但是(shi)(shi)有(you)(you)很多生(sheng)物(wu)(wu)學特(te)(te)性(xing)(xing)(xing)都(dou)不盡相(xiang)同，如(ru)(ru)抗原性(xing)(xing)(xing)相(xiang)差(cha)很遠、中間宿主不同、引起人體(ti)發病(bing)的(de)(de)(de)癥(zheng)狀也截然(ran)不同；兩(liang)者雖然(ran)從同一病(bing)毒(du)(du)(du)得來(lai)(lai)，但是(shi)(shi)在進化(hua)的(de)(de)(de)過程(cheng)中發生(sheng)了很大的(de)(de)(de)變化(hua)，構建(jian)的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)YF/JE(S)其生(sheng)物(wu)(wu)學特(te)(te)性(xing)(xing)(xing)也有(you)(you)所改變，如(ru)(ru)神經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)和神經(jing)外(wai)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)都(dou)有(you)(you)所降低，和其供體(ti)株(zhu)SAl4一l4—2相(xiang)似；而構建(jian)的(de)(de)(de)另一個嵌合(he)株(zhu)YF/JE(N)神經(jing)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)卻很高，和供體(ti)株(zhu)Nakayama特(te)(te)性(xing)(xing)(xing)一致；這說(shuo)明確實如(ru)(ru)原先預料，和減毒(du)(du)(du)有(you)(you)關的(de)(de)(de)表(biao)位主要存在E蛋白中，而同時(shi)也發現，和原來(lai)(lai)的(de)(de)(de)SA14-14-2相(xiang)比較，嵌合(he)株(zhu)在細胞中復制(zhi)能力(li)升高，病(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度(du)較高，免疫原性(xing)(xing)(xing)增加，這又說(shuo)明是(shi)(shi)YF一17DD病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)非結構蛋白發揮作用(yong)。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合病毒
候選疫苗
日(ri)本腦(nao)炎是(shi)(shi)一(yi)(yi)種(zhong)影響(xiang)中(zhong)(zhong)樞(shu)神(shen)經系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)(bing)，主要(yao)流行(xing)于亞洲(zhou)，但是(shi)(shi)近年在澳洲(zhou)、美洲(zhou)也有(you)病(bing)(bing)例(li)(li)(li)發生(sheng)，每(mei)年官方報(bao)道全(quan)球(qiu)有(you)5萬病(bing)(bing)例(li)(li)(li)，其(qi)中(zhong)(zhong)有(you)l萬例(li)(li)(li)是(shi)(shi)致死性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)；雖然目(mu)前(qian)(qian)有(you)活(huo)疫(yi)(yi)苗、滅活(huo)疫(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)使用，但是(shi)(shi)這(zhe)些疫(yi)(yi)苗具(ju)有(you)免疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)(xing)不(bu)夠(gou)、價格偏高、制作工藝(yi)不(bu)被WHO認可(ke)等劣(lie)勢，所以還有(you)必(bi)要(yao)開發研制新疫(yi)(yi)苗。1999年Chambers等以SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)prM和(he)E基(ji)因代替YF一(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)苗株(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相應基(ji)因構(gou)建(jian)了嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病(bing)(bing)毒(du)(du)能在WHO認可(ke)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞中(zhong)(zhong)很(hen)好(hao)地被培養(yang)，恢復病(bing)(bing)毒(du)(du)和(he)YF一(yi)(yi)17DD、SA14—14-2相比較，以6log0pfu的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)腦(nao)內接(jie)(jie)種(zhong)3-4周齡小鼠無一(yi)(yi)例(li)(li)(li)發病(bing)(bing)，而(er)接(jie)(jie)種(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)小鼠全(quan)部死亡；另外用3．2log0pfu劑量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)(jie)種(zhong)，能在85%一(yi)(yi)95%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)接(jie)(jie)種(zhong)者中(zhong)(zhong)產生(sheng)中(zhong)(zhong)和(he)抗體(ti)，抗體(ti)平均(jun)滴度能夠(gou)達到PRNT~o<30，血清陽(yang)轉(zhuan)(zhuan)率小于80%；而(er)接(jie)(jie)種(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)疫(yi)(yi)苗后，能夠(gou)達到100%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血清陽(yang)轉(zhuan)(zhuan)率，接(jie)(jie)種(zhong)后30dPRNT能夠(gou)達到129~327，這(zhe)些結果(guo)表明(ming)構(gou)建(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)神(shen)經內毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)呈大幅(fu)度降低；用乳(ru)鼠以及猴(hou)子(zi)進(jin)行(xing)安全(quan)試(shi)驗(yan)檢測(ce)，進(jin)一(yi)(yi)步證實了該病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)弱神(shen)經毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)，內臟毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)也下降。目(mu)前(qian)(qian)該疫(yi)(yi)苗已(yi)經通過一(yi)(yi)期臨(lin)床試(shi)驗(yan)，是(shi)(shi)很(hen)有(you)前(qian)(qian)途的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疫(yi)(yi)苗候選株(zhu)。
登革病毒多(duo)價(jia)疫苗
登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)是目前誘發(fa)(fa)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)最多的(de)(de)(de)黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，在(zai)(zai)人(ren)口聚集的(de)(de)(de)熱(re)帶(dai)及亞熱(re)帶(dai)時(shi)有(you)爆發(fa)(fa)，因為(wei)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)4個(ge)血清型(xing)(xing)之間(jian)可以(yi)(yi)產(chan)生交叉保護力，所以(yi)(yi)感染一(yi)種(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)后，能(neng)夠對另外(wai)3種(zhong)血清型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)反應。在(zai)(zai)機(ji)體(ti)(ti)遭受另一(yi)種(zhong)血清型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)感染后，由于(yu)抗(kang)體(ti)(ti)依賴的(de)(de)(de)復(fu)制(zhi)能(neng)力增強作用可能(neng)誘發(fa)(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)發(fa)(fa)生，因此理想的(de)(de)(de)疫(yi)(yi)苗應該(gai)能(neng)夠產(chan)生針(zhen)對4個(ge)型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)中和(he)抗(kang)體(ti)(ti)和(he)T細(xi)胞(bao)免疫(yi)(yi)。目前主要有(you)兩個(ge)實(shi)驗(yan)室分別以(yi)(yi)DEN一(yi)2PDK一(yi)53和(he)YF一(yi)17DD作為(wei)受體(ti)(ti)株構(gou)建了包(bao)括DEN一(yi)1到(dao)DEN-4型(xing)(xing)的(de)(de)(de)嵌合株，結果有(you)很好的(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)原性(xing)、較高的(de)(de)(de)復(fu)制(zhi)效率和(he)穩定性(xing)，在(zai)(zai)動物實(shi)驗(yan)中證明(ming)毒(du)(du)(du)性(xing)減低，小鼠效力實(shi)驗(yan)安(an)全有(you)效，有(you)望成為(wei)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)疫(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)發(fa)(fa)展方(fang)向。
另(ling)外還有(you)YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)(de)報道，都出(chu)現一(yi)些令人滿意的(de)(de)特性(xing)，進(jin)一(yi)步研究正(zheng)在進(jin)行中。嵌(qian)(qian)合病毒(du)的(de)(de)出(chu)現是獲得減(jian)毒(du)活(huo)疫(yi)苗的(de)(de)一(yi)個新(xin)途徑，和傳統(tong)方法相比(bi)具有(you)目標明確、免(mian)疫(yi)效果(guo)好、減(jian)毒(du)穩定的(de)(de)優勢，但(dan)該(gai)技術目前還處于探索階段，有(you)時結果(guo)很出(chu)人意料，所以在構建一(yi)個新(xin)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合體時，要時刻注意安全性(xing)問題，否(fou)則會適(shi)得其反，創(chuang)造出(chu)新(xin)的(de)(de)毒(du)性(xing)更(geng)強的(de)(de)病毒(du)，為人類帶來危害。
嵌(qian)合(he)疫苗(miao)是應(ying)用基因工程(cheng)手段(duan)構建基因能表達兩種(zhong)以上病(bing)原體抗原的一類新型疫苗(miao),應(ying)用嵌(qian)合(he)疫苗(miao)可解(jie)決多次接種(zhong)問題。本文綜述(shu)了目(mu)前(qian)世界一些國家研(yan)制的嵌(qian)合(he)疫苗(miao),如登革(ge)病(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)毒(du)、呼吸道合(he)胞病(bing)毒(du)、副流(liu)感病(bing)毒(du)、人(ren)類免(mian)疫缺陷(xian)病(bing)病(bing)毒(du)及人(ren)乳(ru)頭瘤病(bing)毒(du)等(deng)相關(guan)嵌(qian)合(he)疫苗(miao)的研(yan)究策略和方法、免(mian)疫學(xue)評(ping)價及其應(ying)用前(qian)景。
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