黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬(1qav/virus)包含(han)80多(duo)個成(cheng)員(yuan),屬于正鏈RNA病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du),其(qi)中半(ban)數以上(shang)(shang)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)能夠誘(you)發(fa)人和動物產生疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing),患(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)率高而(er)治愈率低,容易(yi)留下一些嚴(yan)重的(de)(de)后遺癥,給(gei)人類健(jian)康帶來很大威脅,如流行性乙型腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(JEV)、登革熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(DEN)、黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(YFV)、蜱傳腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(TBEV)等(deng)。一直(zhi)以來人們對RNA病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)了(le)解都比較(jiao)缺乏,無論(lun)是分子水平上(shang)(shang)的(de)(de)機理研究,還是宏觀(guan)上(shang)(shang)疫(yi)苗的(de)(de)研制、藥物的(de)(de)開發(fa),其(qi)進(jin)展都非常(chang)緩慢(man)。
嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)是一(yi)種基因工程重(zhong)組病毒(du)(du)(du),在制(zhi)備(bei)技術上并不存在太大問題,但作(zuo)為重(zhong)組病毒(du)(du)(du),在安全(quan)性(xing)上還(huan)有一(yi)定的(de)(de)風險(xian),在自(zi)然條件下(xia)(xia),有病毒(du)(du)(du)之間(jian)自(zi)發(fa)產生重(zhong)組的(de)(de)例子,可(ke)能獲(huo)得一(yi)些意想不到的(de)(de)新型病毒(du)(du)(du),比母體(ti)(ti)株毒(du)(du)(du)力更強,對生物體(ti)(ti)更具有威(wei)脅性(xing)。所(suo)以(yi)在制(zhi)備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)時(shi),要采用已知特性(xing)的(de)(de)病毒(du)(du)(du)株作(zuo)為嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)的(de)(de)骨架結構,特別是多選用減毒(du)(du)(du)株作(zuo)為載(zai)體(ti)(ti)病毒(du)(du)(du)目(mu)前黃熱病毒(du)(du)(du)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)采用的(de)(de)載(zai)體(ti)(ti)主要有以(yi)下(xia)(xia)幾種。
YF一(yi)17DD 疫(yi)苗株 YF一(yi)17DD是目前(qian)預防黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)感染的(de)一(yi)株減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)活(huo)疫(yi)苗】,始用于1936年(nian)(nian),在過(guo)去的(de)6O多年(nian)(nian)中(zhong)(zhong)(zhong),有超過(guo)3億人接種過(guo)該疫(yi)苗,安(an)全有效。該疫(yi)苗株免疫(yi)原性很好,單劑量(liang)接種后10d內(nei),近lo0%的(de)接種者產生中(zhong)(zhong)(zhong)和抗(kang)體(ti)(ti),免疫(yi)力持久甚至能夠維持終身(shen)。將YF一(yi)17DD疫(yi)苗株和原病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株YF—Asibi進行序列比(bi)較后發現(xian),該病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)抗(kang)原表位多集中(zhong)(zhong)(zhong)在E基(ji)因(yin),構(gou)建(jian)(jian)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)多以(yi)這一(yi)段基(ji)因(yin)作為(wei)(wei)靶基(ji)因(yin)。這樣(yang)構(gou)建(jian)(jian)的(de)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)中(zhong)(zhong)(zhong),由(you)YF一(yi)17DD株保留的(de)NS蛋白基(ji)因(yin)只是誘發針(zhen)對(dui)該蛋白的(de)CTLs和非中(zhong)(zhong)(zhong)和性抗(kang)體(ti)(ti),而不具有交叉保護性,所(suo)以(yi)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)作為(wei)(wei)疫(yi)苗使用時不會引起一(yi)般(ban)重組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)帶來的(de)抗(kang)載(zai)體(ti)(ti)免疫(yi)反(fan)應,即使曾經接種過(guo)YF一(yi)17DD的(de)接痘(dou)者再接種嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)也是安(an)全有效的(de),可以(yi)作為(wei)(wei)一(yi)個理想的(de)活(huo)疫(yi)苗株嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)載(zai)體(ti)(ti)。1989年(nian)(nian)Rice等(deng)151構(gou)建(jian)(jian)了YF一(yi)17DD的(de)感染性克隆,為(wei)(wei)構(gou)建(jian)(jian)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)提供了方便,目前(qian)文(wen)獻中(zhong)(zhong)(zhong)報道的(de)有關黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)嵌(qian)合(he)(he)株多以(yi)此(ci)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株作為(wei)(wei)載(zai)體(ti)(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)。已經成功(gong)構(gou)建(jian)(jian)了包括(kuo)JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個血清型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)嵌(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)。
YF一17DD 疫苗(miao)株
DEN一(yi)4變(bian)(bian)異株(zhu) 登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)分為(wei)4個(ge)血(xue)清型,這(zhe)4型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結構(gou)蛋(dan)白氨基酸(suan)序列同源性(xing)高達62%-74%,并且它們(men)(men)之間還(huan)有很(hen)好的(de)交叉免(mian)疫原(yuan)性(xing),一(yi)直以來,人們(men)(men)試圖構(gou)建登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)4價疫苗,Bray等從(cong)1991年開(kai)始登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)研究,以DEN一(yi)4814669株(zhu)全長克隆作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)(ti),構(gou)建了(le)包括DEN—l到DEN一(yi)3的(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du),結果(guo)發現幾(ji)株(zhu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)毒(du)(du)(du)性(xing)并沒(mei)有太大(da)改變(bian)(bian),他們(men)(men)認為(wei)若能(neng)夠以一(yi)個(ge)毒(du)(du)(du)性(xing)低的(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)(ti)骨架,可(ke)能(neng)會使嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing)下(xia)降,由于(yu)3端和5端非編碼區在病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復(fu)制中可(ke)能(neng)也起到調控(kong)作(zuo)用,他們(men)(men)在構(gou)建的(de)DEN一(yi)4感染性(xing)克隆的(de)基礎上,刪(shan)除其3端和5端非編碼區的(de)部分序列,結果(guo)篩(shai)選(xuan)到一(yi)株(zhu)減毒(du)(du)(du)株(zhu),其3端去掉(diao)了(le)3O個(ge)核(he)苷(gan)酸(suan),毒(du)(du)(du)性(xing)降低但是免(mian)疫原(yuan)性(xing)并沒(mei)有改變(bian)(bian)。用這(zhe)個(ge)減毒(du)(du)(du)株(zhu)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)(ti)和其它3個(ge)血(xue)清型的(de)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)構(gou)成嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)后(hou),果(guo)然有效(xiao)地降低了(le)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing);其后(hou)這(zhe)個(ge)載(zai)體(ti)(ti)(ti)也用于(yu)構(gou)建黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬其他成員的(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
DEN一4變異株
DEN一(yi)(yi)2 PDK一(yi)(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu) 該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)也主要(yao)是用于合(he)成(cheng)登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗,2O世紀8O年代(dai)初期(qi),泰國(guo)Mahidol實驗室將4種血清型的(de)(de)登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)經(jing)過(guo)在(zai)細胞傳代(dai)中后獲(huo)得各自(zi)的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu),其中以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)效果最(zui)好,免疫(yi)保護力(li)最(zui)強最(zui)持久。將該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和野生株(zhu)(zhu)進行(xing)比(bi)較,發現核苷酸水(shui)平上的(de)(de)變異主要(yao)在(zai)非結構區,說(shuo)明該病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力(li)有關的(de)(de)基因(yin)可能在(zai)非結構區,而(er)黃熱病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)屬其他(ta)成(cheng)員的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力(li)基因(yin)多位于E蛋白,這樣(yang)構建的(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)機(ji)制主要(yao)由供體(ti)株(zhu)(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性起(qi)主要(yao)因(yin)素,而(er)由DEN一(yi)(yi)2PDK-53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)構建的(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)弱由供體(ti)和受體(ti)共同決定,更有利于減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)獲(huo)得
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減毒株
DEN一(yi)(yi)2減毒(du)(du)(du)株作(zuo)為嵌合(he)(he)病毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)載體(ti)還(huan)有(you)另外(wai)一(yi)(yi)個好(hao)處(chu),登革(ge)(ge)(ge)病毒(du)(du)(du)4個血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)之間產生(sheng)交叉免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力,所(suo)以(yi)(yi)異(yi)型(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)二(er)次(ci)感染由于抗體(ti)依賴的(de)(de)(de)(de)(de)增強作(zuo)用可以(yi)(yi)導(dao)致(zhi)登革(ge)(ge)(ge)出血(xue)熱(re)/登革(ge)(ge)(ge)熱(re)休克綜(zong)合(he)(he)征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)生(sheng),理想的(de)(de)(de)(de)(de)登革(ge)(ge)(ge)4價(jia)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗誘(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力要(yao)針對4種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)病毒(du)(du)(du),有(you)效而(er)且(qie)要(yao)持久,其(qi)中任何一(yi)(yi)種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)抗體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)消減都(dou)有(you)發(fa)生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可能。流行病學資料表明(ming),DEN幾個血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)感染人(ren)的(de)(de)(de)(de)(de)概率(lv)是不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de),其(qi)中以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)感染概率(lv)最(zui)高,所(suo)以(yi)(yi)由其(qi)它幾種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應很易識(shi)別(bie)DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du),由此(ci)DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)發(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)概率(lv)明(ming)顯大(da)于DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4;另外(wai)DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)特異(yi)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力又明(ming)顯弱于其(qi)它3型(xing)(xing),所(suo)以(yi)(yi)制(zhi)備以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)2為基礎(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)4價(jia)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗和傳統疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗比(bi)較,減少了DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)4種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)NS3蛋白(bai)誘(you)(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)交叉免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應之間的(de)(de)(de)(de)(de)干擾作(zuo)用,減少了DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可能,同(tong)時(shi)又能有(you)效而(er)持久地誘(you)(you)導(dao)機體(ti)產生(sheng)針對4種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應,從而(er)起到預防作(zuo)用。
克隆(long)(long)法 嵌(qian)合(he)(he)(he)病(bing)毒(du)(du)(du)的獲得大多(duo)是利用(yong)感(gan)染(ran)性克隆(long)(long)技術(shu),目(mu)前已有(you)部分黃熱病(bing)毒(du)(du)(du)屬病(bing)毒(du)(du)(du)獲得了感(gan)染(ran)性克隆(long)(long),如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)毒(du)(du)(du)、墨累(lei)河(he)谷腦炎病(bing)毒(du)(du)(du)(MVE)、西尼羅(luo)河(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(WNV)、DEN4型病(bing)毒(du)(du)(du),這些(xie)克隆(long)(long)包含(han)有(you)病(bing)毒(du)(du)(du)的全部基因(yin)(yin),能(neng)夠(gou)在(zai)宿主(zhu)菌(jun)中穩(wen)定地復制和(he)(he)傳代,以作(zuo)為(wei)種子(zi)批保存。當構建嵌(qian)合(he)(he)(he)體(ti)時,在(zai)供體(ti)基因(yin)(yin)和(he)(he)受體(ti)基因(yin)(yin)的連接處,通過同義突變(bian)(bian)或者(zhe)保守突變(bian)(bian),為(wei)受體(ti)株(zhu)和(he)(he)供體(ti)株(zhu)基因(yin)(yin)組添(tian)加合(he)(he)(he)適(shi)的酶切位點(dian)(dian),然(ran)后將兩者(zhe)利用(yong)酶切位點(dian)(dian)連接起來,制備嵌(qian)合(he)(he)(he)性克隆(long)(long),體(ti)外經(jing)RNA聚(ju)合(he)(he)(he)酶作(zuo)用(yong)轉(zhuan)錄出(chu)嵌(qian)合(he)(he)(he)性轉(zhuan)錄子(zi),轉(zhuan)染(ran)細胞后重新(xin)獲得嵌(qian)合(he)(he)(he)病(bing)毒(du)(du)(du)。這項技術(shu)的一個優點(dian)(dian)在(zai)于在(zai)它是在(zai)cDNA水平上(shang)的操(cao)作(zuo),突變(bian)(bian)率(lv)低(di)、表型穩(wen)定,不像傳統疫苗研制過程中容易發生一系列的生物特性改(gai)變(bian)(bian)。
克隆法
融合(he)PCR 利(li)用(yong)(yong)(yong)PCR技術制備(bei)嵌合(he)病毒最大的優點在于方便快捷,過去幾個(ge)月的工作現在幾天就能完成(cheng)。目前生(sheng)物技術產品日臻完善(shan),不少(shao)公司推(tui)出(chu)高(gao)保真(zhen)、熱穩定性好的逆轉錄(lu)酶和DNA聚合(he)酶,如SuperscriptII逆轉錄(lu)酶、LAro~酶、Exraq酶、ExpandlongtemplatePCR聚合(he)酶系統等(deng),利(li)用(yong)(yong)(yong)這些酶可以(yi)有效地擴(kuo)增出(chu)病毒基因(yin)(yin)組大片段(>5kh)甚(shen)至全長(chang)的cDNA。用(yong)(yong)(yong)4條引物、3次(ci)PCR可以(yi)把兩(liang)個(ge)異質(zhi)基因(yin)(yin)片段連(lian)接在一起。另有報道利(li)用(yong)(yong)(yong)3個(ge)引物、兩(liang)次(ci)PCR即可制備(bei)嵌合(he)基因(yin)(yin),如YF—MOD嵌合(he)病毒。
融合PCR
與克隆技術相(xiang)比較,PCR方法更(geng)為靈活,可以(yi)選擇任意位置進行嵌合;但是PCR具(ju)有一定(ding)的(de)突變(bian)率,可能會帶來一些致死性突變(bian)而使轉錄(lu)體(ti)不(bu)(bu)具(ju)有感(gan)染(ran)性,得不(bu)(bu)到恢復(fu)病(bing)毒(du)從而前功(gong)盡(jin)棄,所(suo)以(yi)現(xian)在(zai)大多數實驗(yan)還是采取克隆法。
滅(mie)活病(bing)毒(du)之間的(de)(de)基因(yin)重組 是將(jiang)兩種(zhong)(zhong)或者兩種(zhong)(zhong)以(yi)(yi)(yi)上(shang)的(de)(de)滅(mie)活病(bing)毒(du),在同一(yi)(yi)細胞內培(pei)養后,它(ta)們之間發(fa)生基因(yin)重組,有時會產(chan)生感(gan)染性(xing)(xing)(xing)病(bing)毒(du),這種(zhong)(zhong)方法又稱為多重復(fu)合(he),可能(neng)由于(yu)滅(mie)活病(bing)毒(du)受損的(de)(de)基因(yin)經重組后得以(yi)(yi)(yi)替補。如為了解包(bao)膜(mo)病(bing)毒(du)的(de)(de)融(rong)合(he)活性(xing)(xing)(xing),利用黃熱(re)病(bing)毒(du)YF一(yi)(yi)17DD和(he)流感(gan)病(bing)毒(du)X31兩者不同的(de)(de)融(rong)合(he)條(tiao)件,以(yi)(yi)(yi)及核衣殼不同的(de)(de)形態,將(jiang)YF一(yi)(yi)17DD通過(guo)(guo)酸處理失去融(rong)合(he)活性(xing)(xing)(xing),X31通過(guo)(guo)熱(re)處理滅(mie)活,兩者在YF一(yi)(yi)17DD滅(mie)活的(de)(de)同一(yi)(yi)pH值下發(fa)生融(rong)和(he)反應(ying),只有發(fa)生融(rong)和(he)反應(ying)的(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)具有感(gan)染性(xing)(xing)(xing);流感(gan)病(bing)毒(du)提供(gong)功能(neng)型(xing)膜(mo)蛋白(bai)融(rong)合(he)成分,YF一(yi)(yi)17DD提供(gong)功能(neng)基因(yin)組,結果兩個滅(mie)活病(bing)毒(du)又重新構建成新的(de)(de)病(bing)毒(du)。這項(xiang)技(ji)術隨機性(xing)(xing)(xing)很大,但是可能(neng)得到意想(xiang)不到的(de)(de)結果,可以(yi)(yi)(yi)用于(yu)病(bing)毒(du)功能(neng)的(de)(de)研究。
黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)構(gou)建前(qian)提在(zai)于,所(suo)有(you)的(de)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)基因組的(de)結(jie)構(gou)是高度保守的(de),它(ta)們(men)均(jun)為單(dan)股正鏈RNA病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du),基因組全長(chang)約l1kb,5端有(you)帽子結(jie)構(gou),3端無poly(A)尾,一個長(chang)的(de)開放閱讀框架覆蓋了大部分(fen)基因組,共編碼3個結(jie)構(gou)蛋(dan)白(bai)和7個非結(jie)構(gou)蛋(dan)白(bai),其(qi)中(zhong)以(yi)E蛋(dan)白(bai)和免疫原性(xing)關系最為密切,所(suo)以(yi)構(gou)建的(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)一般(ban)都(dou)要取供體病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)E基因;但并不是所(suo)有(you)構(gou)建的(de)嵌(qian)(qian)合性(xing)cDNA克隆都(dou)具有(you)感染(ran)性(xing),其(qi)主要影響因素如下。
技術方面 雖(sui)然現在工(gong)具酶的(de)保真性(xing)和效率越(yue)來(lai)越(yue)好,但是黃熱病毒長10kb以上,在基(ji)因(yin)操(cao)作(zuo)中(zhong)不(bu)可避免(mian)有(you)(you)突變(bian)的(de)發生(sheng)(sheng),而(er)有(you)(you)些(xie)突變(bian)是致死性(xing)突變(bian),使得構建的(de)全(quan)長cDNA克隆或者嵌合體克隆沒(mei)有(you)(you)感染性(xing)。另外這些(xie)突變(bian)還影(ying)響恢復(fu)病毒的(de)生(sheng)(sheng)物學特性(xing),如溫度(du)敏感性(xing)、噬斑大小(xiao)、復(fu)制(zhi)能力、嗜細胞能力都可能發生(sheng)(sheng)改(gai)變(bian)。
技術方面
嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian) 結構蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)基(ji)因(yin)之間(jian)的(de)(de)(de)連接處(chu)(chu)有(you)一段親脂區(qu)序列,是構建嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒時(shi)將兩段異質核苷酸(suan)(suan)序列進行(xing)(xing)連接的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處(chu)(chu),這一段序列的(de)(de)(de)保守(shou)性對于嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)復制能力至關重(zhong)要(yao)。如在prM和(he)C基(ji)因(yin)之間(jian)有(you)信號(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)以及蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),Cau—four等在構建YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒時(shi)選(xuan)擇(ze)這兩處(chu)(chu)作為嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),結果在信號(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處(chu)(chu)嵌(qian)合(he)的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒有(you)感染(ran)性,而(er)在蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處(chu)(chu)進行(xing)(xing)連接無(wu)法獲得病(bing)(bing)毒,因(yin)為在兩個(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)之間(jian)有(you)一段親脂性的(de)(de)(de)轉膜區(qu),YFv這一區(qu)域(yu)比DEN一2該區(qu)域(yu)要(yao)多(duo)6個(ge)氨基(ji)酸(suan)(suan);在蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處(chu)(chu)構建的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)體(ti),由于這一轉膜區(qu)缺少了6個(ge)氨基(ji)酸(suan)(suan),蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)和(he)信號(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)不能正確識別切割(ge)(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),從而(er)影響prM蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)和(he)E蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)成熟,病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)復制過程受(shou)到阻礙,病(bing)(bing)毒顆(ke)(ke)粒沒法進行(xing)(xing)正常(chang)的(de)(de)(de)包(bao)裝,所(suo)以無(wu)法分泌出(chu)病(bing)(bing)毒顆(ke)(ke)粒。
嵌合位點
供(gong)體病(bing)毒(du)基(ji)因 目(mu)前(qian)構建的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)多為供(gong)體株提供(gong)P和E基(ji)因,人(ren)們(men)也嘗試過替(ti)代C基(ji)因或者部(bu)分基(ji)因,但多數沒有成功,其可能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)原因是(shi)位(wei)于C蛋白區域的(de)(de)(de)(de)(de)保守序(xu)列與受體株病(bing)毒(du)順式結構不(bu)(bu)相容(rong)性,進而(er)對嵌(qian)合病(bing)毒(du)RNA的(de)(de)(de)(de)(de)復制產生了毒(du)性,如Kuniin病(bing)毒(du)RNA復制必(bi)須(xu)有同源C蛋白上的(de)(de)(de)(de)(de)第2位(wei)和第20位(wei)氨基(ji)酸的(de)(de)(de)(de)(de)存,而(er)異質(zhi)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)C蛋白不(bu)(bu)能(neng)(neng)協助Kunjin病(bing)毒(du)復制,所(suo)以無法長(chang)成病(bing)毒(du)顆粒;另(ling)外(wai)也可能(neng)(neng)是(shi)異質(zhi)病(bing)毒(du)之間的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白酶識(shi)別對方序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)力低(di)下,對于C—prM部(bu)位(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)切割效率低(di),影響病(bing)毒(du)正常的(de)(de)(de)(de)(de)裝配(pei)和釋(shi)放能(neng)(neng)力。
供體病毒
受(shou)(shou)體病毒基(ji)(ji)因(yin)(yin) 作為嵌合(he)病毒載體,嵌合(he)病毒中的(de)(de)(de)(de)大部分基(ji)(ji)因(yin)(yin)由受(shou)(shou)體株提供,嵌合(he)病毒的(de)(de)(de)(de)復制(zhi)特性(xing)(xing)也主要由受(shou)(shou)體株的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)控制(zhi),其(qi)中有(you)(you)(you)些序列對于嵌合(he)體的(de)(de)(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)有(you)(you)(you)決定性(xing)(xing)作用,在構(gou)建(jian)(jian)嵌合(he)體時(shi),如(ru)果這部分序列受(shou)(shou)到破壞,就(jiu)不(bu)能夠獲(huo)得恢復病毒。如(ru)在構(gou)建(jian)(jian)DEN一(yi)4和WNV的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病毒時(shi)四,由WNVNY99的(de)(de)(de)(de)prM和E基(ji)(ji)因(yin)(yin)代替DEN一(yi)4相應位(wei)置的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin),在構(gou)建(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)18個(ge)克隆(long)(long)(long)中僅有(you)(you)(you)兩(liang)個(ge)具有(you)(you)(you)感(gan)染(ran)性(xing)(xing),序列比較發現這兩(liang)個(ge)克隆(long)(long)(long)在prM和C蛋白之間的(de)(de)(de)(de)NS2A—NS2B蛋白酶(mei)切割位(wei)點(dian)下游,在轉膜信號(hao)區域中都包含一(yi)基(ji)(ji)序,這一(yi)基(ji)(ji)序是酶(mei)切割位(wei)點(dian)下游的(de)(de)(de)(de)第3位(wei)及第6位(wei)分別為天冬(dong)氨酸(suan)和蘇氨酸(suan),另(ling)外(wai)16個(ge)克隆(long)(long)(long)則沒有(you)(you)(you)該位(wei)點(dian),實驗表(biao)明(ming)這兩(liang)個(ge)位(wei)點(dian)似乎和嵌合(he)性(xing)(xing)克隆(long)(long)(long)的(de)(de)(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)有(you)(you)(you)關。
受體病毒
嵌合病毒(du)的(de)一(yi)(yi)個最大(da)特點是表型多發生(sheng)變(bian)(bian)化,如復制(zhi)能力(li)、毒(du)力(li)、抗原性(xing)等,可能的(de)原因(yin)是由(you)于缺乏校正(zheng)功能的(de)聚合酶存在,而(er)有(you)異(yi)質基(ji)因(yin)的(de)正(zheng)鏈RNA病毒(du),在病毒(du)復制(zhi)中具有(you)較高的(de)基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)(bian)率,并且(qie)這些突(tu)變(bian)(bian)為了適應不同的(de)宿主細胞,可能會發生(sheng)一(yi)(yi)些特性(xing)改變(bian)(bian),從而(er)出現一(yi)(yi)些預想不到(dao)的(de)結果(guo)。
生長(chang)特性(xing)改(gai)變 嵌合(he)病(bing)毒(du)的(de)兩個母體病(bing)毒(du)的(de)易感細胞(bao)不(bu)同,得到的(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)在不(bu)同細胞(bao)中(zhong)復(fu)制時,由于缺乏有效的(de)復(fu)制酶而引起生長(chang)特性(xing)的(de)改(gai)變,其嗜(shi)細胞(bao)性(xing)也會(hui)有所(suo)改(gai)變,另外(wai)噬(shi)斑(ban)(ban)試驗(yan)中(zhong)噬(shi)斑(ban)(ban)形態
生長特性改變
大(da)小(xiao)都(dou)多有(you)變(bian)化。如Chimeri—JE嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)Vero、LLC—MK,、C6/36細胞(bao)(bao)中(zhong)復制(zhi)(zhi)形式類(lei)似(si),而在(zai)MRC一(yi)(yi)5、FRhl細胞(bao)(bao)中(zhong)雖然病毒(du)滴度能(neng)夠(gou)達到6log。0pfu/mL,但(dan)是卻(que)(que)不(bu)(bu)能(neng)產生CPE,這些特性和母體(ti)株YFV以及JEV都(dou)截然不(bu)(bu)同。LGT1和E5是TBEV的兩個弱毒(du)株,與(yu)DEN一(yi)(yi)4病毒(du)組(zu)成的嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)猿猴(hou)細胞(bao)(bao)中(zhong)復制(zhi)(zhi)能(neng)力(li)下降,而轉(zhuan)染蚊蟲細胞(bao)(bao)復制(zhi)(zhi)能(neng)力(li)不(bu)(bu)受影響,用(yong)在(zai)蚊蟲細胞(bao)(bao)傳代的嵌(qian)合(he)病毒(du)在(zai)猿猴(hou)細胞(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)不(bu)(bu)能(neng)夠(gou)形成噬斑,而在(zai)早期(qi)構(gou)建(jian)的DEN一(yi)(yi)4和另一(yi)(yi)個TBEV病毒(du)株構(gou)建(jian)的嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)猿猴(hou)細胞(bao)(bao)中(zhong)卻(que)(que)能(neng)夠(gou)得到比DEN一(yi)(yi)4病毒(du)滴度高1000倍的嵌(qian)合(he)病毒(du)。
神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)和神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)外毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing) 神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)內(nei)(外)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)低而免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)好是一個(ge)理想疫(yi)(yi)苗應具備(bei)的(de)(de)(de)品質(zhi),許多(duo)(duo)實驗室經(jing)(jing)(jing)過(guo)多(duo)(duo)年研(yan)(yan)究雖然篩檢出一些(xie)(xie)減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株,但是兩(liang)者多(duo)(duo)不(bu)能達(da)到(dao)有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)統一。嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)技術以“取長補短”的(de)(de)(de)原則(ze),將(jiang)兩(liang)種(zhong)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)和毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)結合(he)起來,以期研(yan)(yan)制理想疫(yi)(yi)苗,就目前得到(dao)的(de)(de)(de)一些(xie)(xie)嵌(qian)合(he)株來說,確實取得了一些(xie)(xie)令人滿意的(de)(de)(de)結果,如DEN一4和WNV的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)與WNV相比高度減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)四,腦(nao)內(nei)接(jie)種(zhong)戒奶小鼠(shu),神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)降(jiang)低至(zhi)1/28500;腹腔內(nei)接(jie)種(zhong)小鼠(shu),神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)外毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)下(xia)降(jiang)至(zhi)1/10000,免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)好,能安(an)全保護(hu)小鼠(shu)接(jie)受野生株攻(gong)擊(ji)。另外如ChimeriVax—JE嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)也較母(mu)體株YFV和JEV呈大幅度下(xia)降(jiang),而單劑量又具備(bei)很好的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)保護(hu)力;還有(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株的(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)都有(you)所下(xia)降(jiang),這些(xie)(xie)嵌(qian)合(he)體都在(zai)進一步的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究中。
神經內毒性和神經外毒性
基因(yin)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)(xing) 因(yin)為(wei)RNA病(bing)毒(du)(du)(du)易以(yi)準(zhun)種(zhong)的(de)(de)(de)(de)形(xing)式出(chu)現和易變異(yi)的(de)(de)(de)(de)特性(xing)(xing)(xing)(xing),作為(wei)活疫(yi)苗來使用,一個重要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)條件是基因(yin)型(xing)要(yao)(yao)穩定(ding)(ding)(ding),這一點是疫(yi)苗安(an)全性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)重要(yao)(yao)表現。嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)(xing)主要(yao)(yao)通過(guo)返(fan)祖實驗檢定(ding)(ding)(ding),即在(zai)(zai)乳鼠腦(nao)內和細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)進行(xing)培(pei)養,觀察有(you)(you)無明顯表型(xing)變化,必要(yao)(yao)時(shi)進行(xing)核(he)苷(gan)酸(suan)鑒定(ding)(ding)(ding),如(ru)ChimeriVax-JE嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)115.161在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)(bao)內傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)l8次(ci)以(yi)及在(zai)(zai)乳鼠腦(nao)內傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)6次(ci)并沒有(you)(you)毒(du)(du)(du)力(li)的(de)(de)(de)(de)回升,對減毒(du)(du)(du)位(wei)點進行(xing)測序(xu)也沒有(you)(you)發生(sheng)核(he)苷(gan)酸(suan)改變。而有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)(xing)不夠(gou)好如(ru)DEN一2/DEN一4、DEN一2/DEN—l復制能力(li)較(jiao)弱,而經(jing)過(guo)幾次(ci)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)后得到(dao)較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du)(du)滴度,是因(yin)為(wei)發生(sheng)了一些突變。在(zai)(zai)體(ti)外(wai)轉錄時(shi)產生(sheng)了轉錄體(ti)的(de)(de)(de)(de)雜和體(ti),在(zai)(zai)轉染后經(jing)過(guo)細(xi)胞(bao)(bao)復制,復制能力(li)增強(qiang)的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du)(du)逐(zhu)漸占主要(yao)(yao)優(you)勢,在(zai)(zai)LLC—MK2細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)病(bing)毒(du)(du)(du)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)可以(yi)保(bao)持較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)(xing),所以(yi)在(zai)(zai)制備嵌合(he)疫(yi)苗時(shi),應盡量(liang)減少病(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)(zai)哺乳動物細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)代(dai)的(de)(de)(de)(de)次(ci)數(shu)。
基因穩定性
在黃熱病毒嵌合(he)病毒發展的這十(shi)幾(ji)年中(zhong),人(ren)們(men)嘗試構建了多(duo)種嵌合(he)病毒,其中(zhong)大部分是以制備疫苗為目的,另外還用(yong)于(yu)病毒的分子(zi)生物學特性研究。
分子生物學特(te)性(xing)研究 型(xing)內嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)可以(yi)用于了(le)解病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)復制(zhi)(zhi)能(neng)力(li)(li),進一(yi)(yi)步了(le)解各基(ji)因(yin)的功能(neng)。如構建同型(xing)不(bu)同株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)DEN一(yi)(yi)216681/PDK一(yi)(yi)53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)的型(xing)內嵌合疫苗,研究DEN一(yi)(yi)2型(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結構蛋白區對乳(ru)鼠神經毒(du)(du)(du)性(xing)的影響。可以(yi)用于推測病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)力(li)(li)位(wei)點(dian),由2個(ge)JEV病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA克(ke)隆提供5端,3個(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA提供的3端進行組合,感染細胞后重新獲得6種(zhong)重組JEV病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。根據(ju)噬菌斑大小篩選(xuan)到3個(ge)減毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu),比(bi)較(jiao)6種(zhong)重組病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)野生株(zhu)(zhu)的基(ji)因(yin)序列,發(fa)(fa)現(xian)僅僅是E138(Glu—Lys)一(yi)(yi)個(ge)氨基(ji)酸位(wei)點(dian)不(bu)同,說明(ming)這個(ge)位(wei)點(dian)和(he)毒(du)(du)(du)力(li)(li)之(zhi)間(jian)(jian)關系(xi)密切;另外發(fa)(fa)現(xian)該突變(bian)株(zhu)(zhu)雖然毒(du)(du)(du)性(xing)降低,但是腦(nao)內注射接種(zhong)小鼠后仍能(neng)在(zai)(zai)腦(nao)內復制(zhi)(zhi),但是病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度比(bi)較(jiao)低,看來其(qi)減毒(du)(du)(du)機制(zhi)(zhi)不(bu)在(zai)(zai)于病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的復制(zhi)(zhi),而(er)可能(neng)是影響復制(zhi)(zhi)的早(zao)期(qi)機制(zhi)(zhi),在(zai)(zai)細胞之(zhi)間(jian)(jian)傳遞速度比(bi)較(jiao)慢,從而(er)使(shi)免疫系(xi)統能(neng)及時清除病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
分子生物學特性(xing)研究
型間(jian)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)也可(ke)以用(yong)于分子生(sheng)物學特性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)研究,如黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)和(he)日本腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)雖然同(tong)屬黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬,但是有很(hen)(hen)多(duo)生(sheng)物學特性(xing)(xing)都不盡相(xiang)同(tong),如抗原(yuan)(yuan)(yuan)性(xing)(xing)相(xiang)差很(hen)(hen)遠、中(zhong)間(jian)宿主不同(tong)、引起人體(ti)發(fa)病(bing)(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)癥狀也截然不同(tong);兩者雖然從同(tong)一(yi)(yi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)得來(lai),但是在進化(hua)的(de)(de)(de)(de)過程(cheng)中(zhong)發(fa)生(sheng)了(le)很(hen)(hen)大的(de)(de)(de)(de)變化(hua),構(gou)(gou)建的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)YF/JE(S)其生(sheng)物學特性(xing)(xing)也有所(suo)改變,如神經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)和(he)神經(jing)外毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)都有所(suo)降(jiang)低,和(he)其供體(ti)株(zhu)SAl4一(yi)(yi)l4—2相(xiang)似;而構(gou)(gou)建的(de)(de)(de)(de)另(ling)一(yi)(yi)個(ge)嵌合(he)株(zhu)YF/JE(N)神經(jing)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)卻很(hen)(hen)高(gao)(gao),和(he)供體(ti)株(zhu)Nakayama特性(xing)(xing)一(yi)(yi)致(zhi);這(zhe)說明確實如原(yuan)(yuan)(yuan)先預料,和(he)減毒(du)(du)(du)有關(guan)的(de)(de)(de)(de)表位主要存在E蛋白中(zhong),而同(tong)時也發(fa)現,和(he)原(yuan)(yuan)(yuan)來(lai)的(de)(de)(de)(de)SA14-14-2相(xiang)比較(jiao),嵌合(he)株(zhu)在細胞中(zhong)復制能力升高(gao)(gao),病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)較(jiao)高(gao)(gao),免疫原(yuan)(yuan)(yuan)性(xing)(xing)增加,這(zhe)又說明是YF一(yi)(yi)17DD病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)非結構(gou)(gou)蛋白發(fa)揮(hui)作用(yong)。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合(he)病毒
候選疫苗
日本腦炎是(shi)(shi)一種(zhong)(zhong)(zhong)影響中(zhong)(zhong)樞神(shen)經(jing)系統的(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)(bing),主要流行(xing)于亞洲,但是(shi)(shi)近年(nian)在(zai)澳(ao)洲、美(mei)洲也有病(bing)(bing)例(li)發(fa)(fa)生(sheng),每年(nian)官方報道全球有5萬病(bing)(bing)例(li),其中(zhong)(zhong)有l萬例(li)是(shi)(shi)致(zhi)死性的(de)(de)(de);雖然目(mu)前(qian)有活疫(yi)(yi)(yi)苗、滅(mie)活疫(yi)(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)使用,但是(shi)(shi)這(zhe)(zhe)些疫(yi)(yi)(yi)苗具(ju)有免(mian)疫(yi)(yi)(yi)原性不夠(gou)、價格偏(pian)高、制(zhi)作工藝不被(bei)WHO認可(ke)等劣勢,所以(yi)(yi)還有必要開發(fa)(fa)研制(zhi)新疫(yi)(yi)(yi)苗。1999年(nian)Chambers等以(yi)(yi)SA14-14-2的(de)(de)(de)prM和(he)E基(ji)因代替(ti)YF一17DD疫(yi)(yi)(yi)苗株的(de)(de)(de)相應基(ji)因構建了(le)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)ChimeriVax—JE15,16,,該病(bing)(bing)毒(du)能(neng)在(zai)WHO認可(ke)的(de)(de)(de)細(xi)胞中(zhong)(zhong)很好地(di)被(bei)培(pei)養,恢復病(bing)(bing)毒(du)和(he)YF一17DD、SA14—14-2相比(bi)較(jiao),以(yi)(yi)6log0pfu的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)腦內接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)3-4周齡小(xiao)鼠無一例(li)發(fa)(fa)病(bing)(bing),而接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)小(xiao)鼠全部死亡;另外用3.2log0pfu劑量的(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong),能(neng)在(zai)85%一95%的(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)者中(zhong)(zhong)產生(sheng)中(zhong)(zhong)和(he)抗體,抗體平均滴(di)度(du)能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)PRNT~o<30,血清陽(yang)轉率小(xiao)于80%;而接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗后,能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)100%的(de)(de)(de)血清陽(yang)轉率,接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)后30dPRNT能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)129~327,這(zhe)(zhe)些結果表明構建的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)神(shen)經(jing)內毒(du)性呈大幅度(du)降低(di);用乳鼠以(yi)(yi)及猴(hou)子進行(xing)安全試驗(yan)檢測,進一步證(zheng)實了(le)該病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)弱神(shen)經(jing)毒(du)性,內臟毒(du)性也下降。目(mu)前(qian)該疫(yi)(yi)(yi)苗已經(jing)通過(guo)一期臨(lin)床試驗(yan),是(shi)(shi)很有前(qian)途的(de)(de)(de)疫(yi)(yi)(yi)苗候選株。
登革病毒多價疫苗
登革病(bing)毒(du)(du)是目前誘發疾病(bing)最(zui)多的(de)黃熱病(bing)毒(du)(du),在(zai)人口(kou)聚集的(de)熱帶及亞熱帶時有(you)爆發,因為登革病(bing)毒(du)(du)4個(ge)(ge)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)之間可(ke)以產生交叉保(bao)護力(li),所以感染一(yi)(yi)種(zhong)病(bing)毒(du)(du)后(hou),能(neng)夠(gou)對另外3種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)抗體(ti)(ti)反應(ying)。在(zai)機體(ti)(ti)遭受(shou)另一(yi)(yi)種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)感染后(hou),由于(yu)抗體(ti)(ti)依賴的(de)復(fu)制能(neng)力(li)增(zeng)強作用(yong)可(ke)能(neng)誘發DHF/DSS的(de)發生,因此理(li)想的(de)疫(yi)(yi)苗(miao)應(ying)該能(neng)夠(gou)產生針對4個(ge)(ge)型(xing)(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)中和抗體(ti)(ti)和T細胞免(mian)疫(yi)(yi)。目前主要有(you)兩個(ge)(ge)實驗室分別以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53和YF一(yi)(yi)17DD作為受(shou)體(ti)(ti)株構建了包括DEN一(yi)(yi)1到(dao)DEN-4型(xing)(xing)的(de)嵌合株,結果(guo)有(you)很好的(de)免(mian)疫(yi)(yi)原性、較(jiao)高的(de)復(fu)制效(xiao)率和穩定性,在(zai)動物實驗中證明毒(du)(du)性減低,小鼠效(xiao)力(li)實驗安全有(you)效(xiao),有(you)望成為登革病(bing)毒(du)(du)疫(yi)(yi)苗(miao)的(de)發展方向(xiang)。
另外還有(you)(you)YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)(de)(de)(de)(de)報道,都出(chu)現一(yi)些令(ling)人(ren)滿意(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)特性,進一(yi)步研究(jiu)正在進行中。嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)出(chu)現是獲得減毒(du)(du)活(huo)疫苗的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個(ge)新(xin)途(tu)徑,和傳統(tong)方法相比具有(you)(you)目標明(ming)確、免(mian)疫效果好、減毒(du)(du)穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)(de)優勢,但(dan)該技(ji)術目前(qian)還處于(yu)探索(suo)階段(duan),有(you)(you)時結果很(hen)出(chu)人(ren)意(yi)料(liao),所以在構建一(yi)個(ge)新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合體(ti)時,要(yao)時刻注意(yi)安全性問題,否則會適(shi)得其(qi)反,創造出(chu)新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)性更強的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du),為人(ren)類帶來危害(hai)。
嵌(qian)(qian)合疫苗(miao)(miao)是應用基因工程(cheng)手(shou)段構建基因能表達(da)兩種以(yi)上(shang)病原體抗原的一類新型疫苗(miao)(miao),應用嵌(qian)(qian)合疫苗(miao)(miao)可解決(jue)多次接種問題。本文綜(zong)述了(le)目前(qian)世界一些國家(jia)研制的嵌(qian)(qian)合疫苗(miao)(miao),如登革(ge)病毒、乙型腦炎病毒、呼吸道合胞病毒、副流感(gan)病毒、人類免(mian)疫缺陷病病毒及人乳(ru)頭瘤病毒等相關嵌(qian)(qian)合疫苗(miao)(miao)的研究策略和方(fang)法、免(mian)疫學評價及其應用前(qian)景。