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1996年，馬伊琍與保(bao)劍峰、陳(chen)龍、高(gao)曙光、張雅(ya)琳(lin)共(gong)同出演了(le)電視(shi)劇《真空愛情記錄》，講述(shu)了(le)一(yi)群(qun)大學(xue)畢業生為了(le)工作和愛情奮斗的故事。

1998年，馬伊琍畢(bi)業于上海戲劇學院，畢(bi)業后(hou)參演了第一部改(gai)編自陜西駐滬(hu)作家李春平(ping)同名小說的電影《玻璃(li)是透(tou)明的》，飾演“小丫子”。同年，其出演了第一部古裝電影《孔(kong)乙己》。

2000年，通(tong)過出演(yan)《黑洞》提升了表演(yan)事業。同(tong)年，在(zai)電視(shi)劇《前世今(jin)生》中飾(shi)演(yan)美貌且氣質超凡的秦婉(wan)瑩。

2001年(nian)，出演電(dian)(dian)視劇《白天睡(shui)覺的(de)女人(ren)》中的(de)李秀。同年(nian)，在(zai)電(dian)(dian)影《西施(shi)眼(yan)》中飾演施(shi)雨，該片在(zai)2002年(nian)美國夏(xia)威夷國際電(dian)(dian)影節中獲評審團大(da)將及亞洲(zhou)最佳(jia)電(dian)(dian)影。

2002年，因(yin)出演電視劇《還珠格格Ⅲ之天上人間(jian)》中的紫薇一角而被大眾(zhong)所熟(shu)知。

2004年，出(chu)演(yan)了由黃磊指導的《天一生水》，在劇中(zhong)飾演(yan)一個(ge)混血姑娘明妮。

2005年(nian)，在(zai)張黎導(dao)演的(de)電視劇《錦衣(yi)衛》中(zhong)出演了傾國美人(ren)客印月。

2006年，參演(yan)的《喬家大院》在央視熱(re)播(bo)，其(qi)扮演(yan)的“江(jiang)雪瑛”收獲了更多的觀眾和粉絲(si)。

2007年，因出演由趙(zhao)寶剛指導的青春(chun)勵志電視(shi)劇《奮斗》而(er)名聲驟(zou)起，同年6月底，馬(ma)伊琍(li)簽約了內地影視(shi)巨擎橙天娛樂。

2008年，因(yin)拍(pai)攝電(dian)視(shi)劇《為誰心動》無悔剃光了頭。同年，其憑借(jie)影(ying)(ying)片(pian)《江北好人》，戰勝了李冰(bing)(bing)冰(bing)(bing)、范冰(bing)(bing)冰(bing)(bing)兩位候選(xuan)人，成為了長春電(dian)影(ying)(ying)節影(ying)(ying)后。

2009年，馬伊琍(li)與佟(tong)大為共同出演(yan)了(le)電(dian)視劇《婚(hun)姻保衛戰》。同年，出演(yan)的首部(bu)反映豫商故事的電(dian)視劇《經緯(wei)天地》在CCTV-8播出，這也是她繼(ji)《喬家大院》之(zhi)后首次登陸央視，劇中扮演(yan)尚達志的妻子順兒。

2010年(nian)，與涂(tu)松(song)巖(yan)合作(zuo)主演都市(shi)題材電視劇《雙城生活》，她在劇中塑造的北京(jing)大妞郝京(jing)妮，受到了網友的普遍好評。憑借該劇，馬伊琍獲得(de)國劇盛典2011年(nian)度最佳女演員(yuan)。

2013年(nian)年(nian)初，馬伊(yi)琍(li)與杜淳、劉莉(li)莉(li)、陳(chen)思(si)斯等合作(zuo)出(chu)演電視劇《青(qing)春期撞上更年(nian)期2》，此外，還客串了(le)電影《不二神探》，并且徹底顛覆以(yi)往的形象(xiang)痛(tong)罵文(wen)章，成為了(le)影片一(yi)大(da)看(kan)點。

2013年，首當(dang)制片人(ren)的馬(ma)伊琍與首次當(dang)導(dao)演的丈夫文章合作(zuo)了電(dian)視劇《小爸(ba)爸(ba)》。

2015年，出演了公(gong)路犯罪片《未擇之(zhi)路》。11月(yue)7日，在電視劇(ju)《北上廣(guang)不相信眼淚》中飾演潘蕓，憑該劇(ju)獲得第19屆華(hua)鼎(ding)獎(jiang)中國百強電視劇(ju)最佳女主(zhu)角。

2016年9月(yue)，與(yu)陳建斌合作(zuo)主演(yan)都市幽(you)默劇(ju)《中國式(shi)關系》，飾演(yan)美女建筑設計師江一楠。

2017年(nian)，主演文章執導的諜戰劇《剃(ti)刀邊緣》，劇中飾(shi)演關海丹。同(tong)年(nian)參演《建軍大業》，飾(shi)演向警予角色。